Fractalkine對類風濕關節炎患者成纖維樣滑膜細胞中NF－κB活化及內源性fractalkine mRNA表達的影響*

郭興華， 潘云峰△， 宋澤蓉， 王 昆， 古潔若

(中山大學附屬第三醫院1風濕免疫科，2骨科，廣東 廣州 510630)

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以關節滑膜為主要靶組織的慢性系統性炎癥，影響世界上0.5% －1%的人群。滑膜炎癥細胞浸潤以及襯里層增生是其典型病理表現。增生的襯里層主要由巨噬細胞樣滑膜細胞和成纖維細胞樣滑膜細胞(fibroblast－like synoviocyte，FLS)組成。小分子炎癥介質(花生四烯酸代謝產物)、生長因子、趨化因子、黏附因子、基質金屬蛋白酶等觸發滑膜細胞的增殖和活化，侵襲并損壞關節軟骨、軟骨下骨、肌腱和韌帶。因此，炎癥因子對類風濕關節炎的發生和發展都有重要的作用。而傳統的NF－κB通路在類風濕關節炎的炎癥進程中有重要地位。NF－κB是可誘導型二聚體轉錄因子家族中的一員，它擁有5個成分，分別是:Rel(c－Rel)、RelA(p65)、RelB、NF－κB1(p50/p105)和 NF－ κB2(p52/p100)。RA 發病中眾多細胞因子和細胞黏附分子被激活受到NF－κB的轉錄調控［1］。同時，RA滑膜表達的許多炎癥介質又可作用于NF－κB使其活化，如TNF－α和IL－1β［2］，兩者構成一反饋機制，導致 RA 炎癥反應和結構破壞得以維持與發展。

Fractalkine(FKN)，又稱 CX3CL1，是 CX3C類趨化因子中的唯一成員，由373個氨基酸組成的大分子蛋白。CX3CR1是FKN的高親和力受體，屬于趨化因子受體超家族成員。Chandrasekar等［3］在動脈平滑肌細胞中發現，FKN可通過NF－κB誘導平滑肌細胞的增殖。RA－FLS可分泌游離的FKN［4］，但FKN對RA－FLS NF－κB活化及內源性FKN的表達有無影響，尚未見相關報道。本研究觀察FKN刺激RA－FLS后，對細胞中NF－κB活化以及內源性FKN mRNA表達的影響，以期了解FKN對RA中NF－κB活化以及炎癥維持和發展的影響。

材料和方法

1 標本采集

類風濕關節炎患者滑膜組織來自2009年3月－2009年8月中山大學附屬第三醫院行關節置換術，共3例，均取自髖關節。年齡24－50，平均36.3歲，病程8－9年，平均102個月。所有RA患者診斷符合1987年美國風濕病學會(American Rheumatism Association，ARA)類風濕關節炎分類標準。

2 主要試劑

胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)購自杭州四季青公司;重組人fractalkine(CX3CL1/FKN)購自PeproTech;培養細胞RNA提取試劑盒、含裂解液、去蛋白液、漂洗液、DEPC處理水、吸附柱、過濾柱、離心管(1.5 mL)和收集管(2 mL)購自北京天根生化科技有限公司;Fermentas RevertAid第1鏈cDNA合成試劑盒、含DEPC處理水、Oligo(dT)18引物(0.5 g/L)、5×反應緩沖液，Ribolock RNA酶抑制劑(20 g/L)、dNTP混合物和ReverAid M－MuLV反轉錄酶(2×108U/L)購自 Fermentas;2×Taq Plus PCR Master Mix(預染)購自北京天根生化科技有限公司;DNA marker 1購自北京天根生化科技有限公司;引物由廣州英駿生物技術有限公司合成;核蛋白和胞漿蛋白提取試劑盒購自南京凱基生物科技發展有限公司;靶Ⅰ抗:兔抗人抗NF－κB p65單克隆抗體(C22B4)購自Cell Signaling;小鼠抗人抗TATA結合蛋白(TATA －binding protein，TBP)單克隆抗體(MAB3658)購自Millipore;兔抗人抗磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH)多克隆抗體購自廣州藝佳生物;辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標記Ⅱ抗購自武漢博士德。

3 方法

3.1 細胞培養 滑膜組織經無菌條件下處理后，向滑膜組織滴加1－2滴20%FBS培養液，將其銳性剪碎至約1 mm×1 mm×1 mm大小，將組織塊移至培養瓶中，均勻擺放到瓶底，將培養瓶翻轉，使組織塊面位于上方，加入適量20%FBS培養液，置于5%CO2、37℃培養箱中約5 h。將培養瓶輕輕翻轉，使組織塊浸沒于培養液中，避免將組織塊沖起。置于培養箱繼續培養。根據細胞的生長情況及培養液的變化，每1－3 d更換培養液1次。當細胞生長至覆蓋底面＞80%時，可進行消化傳代培養。經消化傳代后獲得較純成纖維樣滑膜細胞［5］。本實驗均使用第3代滑膜細胞。

3.2 NF－κB活化檢測 RA－FLS中加入100 μg/L FKN，分別作用0 h、1 h、2 h后收集細胞，用核蛋白和胞漿蛋白提取試劑盒提取胞核及胞漿蛋白，用Western blotting檢測其胞漿及胞核中NF－κB p65蛋白表達的變化，即取25 μg蛋白(胞核或胞漿蛋白)，經10%SDS－PAGE電泳分離，電轉印到PVDF膜，取膜于5%封閉液中封閉，恒溫搖床搖2 h;洗膜5次后，加入Ⅰ抗(NF － κB p651∶300，TBP 1∶500，GAPDH 1∶500，取抗體稀釋液稀釋)，反應1 h，洗膜5次，每次間隔5 min，加HRP標記Ⅱ抗(1∶1000，取抗體稀釋液稀釋)，反應1 h，洗膜5次，每次間隔5 min，加入增強化學發光(enhanced chemiluminescence，ECL)化學發光液，3－5 min后于暗室顯影后沖洗膠片。用Quantity One軟件進行分析，讀取吸光度值(absorbance，A)，計算各樣本胞漿和胞核中NF－κB p65與胞漿內參(GAPDH)和胞核內參(TBP)的吸光度比值，作為樣本的相對吸光度值，以觀察各樣本胞漿及胞核中NF－κB p65蛋白表達量的變化。

3.3 RT－PCR檢測RA－FLS中FKN mRNA表達RA －FLS中加入100 μg/L FKN，分別作用0 h、12 h及18 h后收集細胞，用培養細胞RNA提取試劑盒提取總RNA，用Fermentas RevertAid第1鏈cDNA合成試劑盒合成 cDNA，即總 RNA 11 μL和 Oligo(dT)181 μg，70 ℃ 反應 5 min，再加 5 × 逆轉錄緩沖液4 μL、RiboLock RNase Inhibitor 1 μL、dNTP Mix(各10 mmol/L)2 μL，37 ℃ 反應 5 min，再加 RevertAid M －MuLV RT 1 μL，42 ℃反應60 min，最后 70 ℃反應10 min，產物用作PCR。用2×Taq Plus PCR Master Mix(預染)行PCR，引物為:CX3CL1正義鏈5’－TACCTGTAGCTTTGCTCATCCA－3’，反義鏈 5’－ACCACAGACTCGTCCATTCC－3’，產物長度為250 bp;β－actin正義鏈 5’－ CGGGACCTGACTGACTACCTC－3’，反義鏈 5’－ACTCGTCATACTCCTGCTTGC－3’，產物長度為547 bp。PCR反應總體積為20 μL，含RT 產物1 μL ，2 ×Taq Plus PCR Master Mix10 μL，上、下游引物各 0.5 μL，ddH2O 8 μL。反應程序:95℃ 5 min后，95℃ 30 s，64℃ 30 s，72℃15 s，35個循環后再72℃ 8 min。擴增產物于含溴化乙啶瓊脂糖凝膠中進行電泳。以目的條帶與βactin的電泳條帶的吸光度值比值作為mRNA的相對表達量并與對照組比較。

4 統計學處理

用SPSS 13.0統計分析軟件進行數據處理，計量資料用均數±標準差()表示，各組間總差異比較用單因素方差分析，兩組間差異比較采用LSD法。

結 果

1 重組人FKN對RA－FLS NF－κB活化的影響

結果顯示，FKN刺激后1 h后胞漿中NF－κB p65蛋白表達量較對照組(0 h)降低(P＜0.05)，見圖1。2 h后胞核中NF－κB p65蛋白表達量較對照組(0 h)升高(P＜0.05)，見圖2，提示FKN對RAFLS中NF－κB有激活作用。

2 重組人FKN對RA－FLS中FKN mRNA表達的影響

RA－FLS中加入100 μg/L重組人FKN分別作用0 h、12 h、18 h，圖3 顯示刺激18 h后 FKN mRNA表達量高于對照組(0 h)(P＜0.05)，提示在0－18 h范圍內，隨著時間延長，FKN促進RA－FLS內源性FKN mRNA表達增加。

討 論

Figure 1.Effect of FKN on NF－ κB activity in RA －FLS cytoplasm.NF－κB p65 protein of cytoplasm was detected by Western blotting 0 h，1 h and 2 h after treatment with 100 μg/L FKN..n=3.*P ＜0.05 vs 0 h group.圖1 FKN對RA－FLS胞漿中NF－κB的作用

Figure 2.Effect of FKN on NF－κB activity in RA －FLS nucleus.NF － κB p65 protein in nucleus was examined by Western blotting.0 h，1 h and 2 h after 100 μg/L FKN treatment..n=3.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs 0 h group.圖2 FKN對RA－FLS胞核中NF－κB的作用

Figure 3.Effect of FKN on the expression of FKN mRNA.RAFLS were stimulated with 100 μg/L FKN，and FKN mRNA expression was detected by RT－PCR at different time points.M:DNA marker 1..n=3.*P＜0.05 vs 0 h group.圖3 FKN對RA－FLS中FKN mRNA表達的影響

NF－κB是一種廣泛表達的轉錄因子，誘導許多炎癥細胞和炎癥介質產生并導致疾病進展［6］。本實驗運用了NF－κB活化后從胞漿轉移胞核的原理，檢測胞漿和胞核內p65蛋白表達的變化，以證明NF－κB通路是否被活化。實驗中顯示，當加入100 μg/L FKN 1 h后，胞漿中的p65蛋白即減少，而2 h后胞核中的NF－κB p65蛋白上升，提示當加入FKN后1h NF－κB p65開始轉移至胞核，2 h后可檢測出胞核內p65蛋白上升，即FKN可激活NF－κB通路。在類風濕滑膜中有豐富的NF－κB，免疫組化分析證實在滑膜襯里層的細胞核中存在p50和p65表達量比較豐富，尤其是 p65的表達［7］。NF－κB參與了RA炎癥中許多細胞因子的表達，在與RA有密切關系的基因的表達中發揮關鍵作用，如單核細胞中的IL－1β、滑膜細胞中的 ICAM －1、TNF－α、IL－6和IL－8。同時滑膜細胞還產生許多酶，這些酶可以降解細胞外基質，破壞軟骨和骨質。NF－κB抑制劑可抑制人巨噬細胞和初期RA滑膜細胞這些破壞性酶(如金屬蛋白酶、蛋白聚糖酶)和炎癥因子(如IL－1β、IL－6、IL－8和 TNF－α)的產生，提示 NF－κB是這些酶和炎癥因子合成的基礎因素［8］。因此，FKN對NF－κB的活化可促進炎癥發展、軟骨和骨質的破壞。

進一步實驗發現，當加入外源的FKN刺激RA－FLS 18 h后，可表現出其促進內源性FKN mRNA表達的作用，提示RA－FLS中可能存在FKN正反饋現象。在RA患者關節中存在各種各樣的炎癥因子，部分還可提升FKN表達，起到放大作用，如IFNγ和TNF－α［9］。FKN的這種正反饋作用及其它炎癥因子的放大作用可導致RA關節內FKN大量聚集。FKN有黏附、趨化、促進細胞滲出的作用，因此其大量聚集可影響前炎癥細胞在關節內浸潤和導致CX3CR1+細胞聚集。表達 CX3CR1的細胞包括Th1、Tc1、γδT、NK 細胞、大部分 CD16+NK 細胞、多數的CD14+單核細胞和部分的CD3+T細胞。Th1和Tc1細胞可分泌IFN－γ、TNF－β和IL－2，介導針對細胞內抗原的免疫反應和器官特異性的自身免疫反應。γδT細胞和 NK細胞可表達 CD57、CD11b(細胞毒淋巴細胞的有效標志)和分泌穿孔素和粒酶B。這些提示CX3CR1+細胞是高選擇性的趨化細胞毒作用的淋巴細胞(包括NK細胞、細胞毒T細胞和γδT細胞)［10］。這致使大量細胞毒淋巴細胞在關節內聚集，炎癥進一步擴大。

除了介導遷移，FKN和CX3CR1還可增強炎癥細胞的破壞能力。游離FKN可誘導NK細胞滲出和增強其脫顆粒和溶解細胞的作用，表達CX3CR1的CD8+T細胞具有更強大的細胞毒作用［10］。Yoneda等［11］報道，用固化的FKN刺激NK細胞，或用表達FKN的細胞與NK細胞共培養，可明顯上調IFN－γ。Nanki等［12］報道表達 CX3CR1的 CD4+和 CD8+T 細胞在RA患者中增多，這些T細胞都產生IFN－γ和TNF－α。IFN－γ又可促進內皮細胞中FKN的表達［13］，這樣一個旁分泌正反饋循環，導致RA關節中FKN進一步積聚，繼而趨化更多細胞毒作用的淋巴細胞遷移至關節中，并且這些淋巴細胞的作用被加強，最終可能加重RA關節中炎癥程度和關節的破壞。

在RA滑膜中，CX3CR1可在巨噬細胞、成纖維細胞、內皮細胞和樹突狀細胞中表達。這提示FKN還可能對這些細胞產生生物效應。CD68+CD16+［14］和CD14+CD16+單核細胞表達CX3CR1，細胞通過CD16與CX3CR1相互作用聚集在滑膜襯里層及滑膜下層中。CD14+CD16+單核細胞表達一些特殊類型的表面分子，而且可產生TNF－α、IL－1β和IL－6，低表達或不表達抗炎因子IL－8，因此這群細胞可迅速地遷移至炎癥部位，迅速成熟為促炎癥巨噬細胞。游離FKN還可誘導單核細胞分泌IL－1β和IL－6［15］。滑液中CD14+單核細胞表達FKN和CD3+T細胞表達CX3CR1分別與晨僵和腫脹關節數有關［15］。Volin等［16］發現 pmol/L 及 nmol/L 級的游離FKN對人微血管內皮細胞均有趨化和激動的作用，可誘導更多內皮小管形成，將固化有FKN的基質膠移植到小鼠中，可見新血管形成。FKN還可促進MMP的分泌，進而導致軟骨的破壞［17］。

進入核內的NF－κB識別共同的DNA序列，調節一系列靶基因，特別是參與人體免疫系統和抵御病原體的基因的表達，包括許多細胞黏附分子、趨化因子及急性反應蛋白等［3］。RA發病中眾多細胞因子和細胞黏附分子受到NF－κB的轉錄調控，如細胞因子(如 TNF－α、IL－1β、IL－6、IL－2、IL－12、IFN － γ、GM －CSF、EGF［18］)、細胞黏附分子(如選擇蛋白、VCAM －1、ICAM －1)，化學增活素(如 IL－8、MIP－1α、MCP －1、RANTES、嗜酸細胞活化趨化因子)、基質金屬蛋白酶(MMP－1、MMP－3、MMP－13)、受體(如 MHC)和誘導酶(如 COX－1、iNOS)［19］。本實驗結果提示 RA－FLS中可能存在FKN正反饋現象，FKN對NF－κB有活化作用。在平滑肌細胞中，NF－κB的活化可增加 FKN的表達［3］。在 RA －FLS中，NF－κB的活化是否增加FKN的表達，FKN基因啟動子中是否存在NF－κB的結合位點，有待后續研究進一步探討。

［1］Roman－blas JA，Jimenez SA.NF－κB as a potential therapeutic target in osteoarthritis and rheumatoid arthritis［J］.Osteoarthritis Cartilage，2006，14(9):839 －848.

［2］Lee YR，Kweon SH，Kwon KB，et al.Inhibition of IL －1β － mediated inflammatory responses by the IκBα super－repressor in human fibroblast－ like synoviocytes［J］.Biochem Biophys Res Commun，2009，378(1):90－94.

［3］Chandrasekar B，Mummidi S，Perla RP，et al.Fractalkine(CX3CL1)stimulated by nuclear factor κB(NF －κB)－ dependent inflammatory signals induces aortic smooth muscle cell proliferation through an autocrine pathway［J］.Biochem J，2003，373(2):547 －558.

［4］Volin MV，Huynh N，Klosowska K，et al.Fractalkine is a novel chemoattractant for rheumatoid arthritis fibroblastlike synoviocyte signaling through MAP kinases and Akt［J］.Arthritis Rheum，2007，56(8):2512－2522.

［5］肖楚吟，潘云峰，郭興華，等.滑膜成纖維細胞的原代培養及生物特性［J］.中國醫學工程，2010，18(2):1－4.

［6］韓 梅，溫進坤，劉月平，等.大鼠血管新生內膜形成過程中NF－κB的活化和ICAM－1及COX－2表達的變化［J］.中國病理生理雜志，2008，24(2):257 －260.

［7］Sioud M，Mellbye O，Forre O.Analysis of the NF－κB p65 subunit，Fas antigen，Gas ligand and Bcl－2 －related proteins in the synovium of RA and polyarticular JRA［J］.Clin Exp Rheumatol，1998，16(2):125 － 134.

［8］Bondeson J，Lauder S，Wainwright S，et al.Adenoviral gene transfer of the endogenous inhibitor IκBα into humanosteoarthritis synovial fibroblasts demonstrates that several matrix metalloproteinases and aggrecanases are nuclear factor－ κB － dependent［J］.J Rheumatol，2007，34(3):523－533.

［9］Fraticelli P，Sironi M，Bianchi G，et al.Fractalkine(CX3CL1)as an amplification circuit of polarized Th1 responses［J］.J Clin Invest，2001，107(9):1173 －1181.

［10］Umehara H，Bloom ET，Okazaki T，et al.Fractalkine and vascular injury［J］.Trends Immunol，2001，22(11):602－607.

［11］Yoneda O，Imai T，Inoue H，et al.Membrane bound form of fractalkine induces IFN－γ production by NK cells:a role for Th1 response［J］.Eur J Immunol，2003，33(1):53－58.

［12］Nanki T，Imai T， Nagasaka K， et al.Migration of CX3CR1－positive T cells producing type 1 cytokines and cytotoxic molecules into synovium of patients with rheumatoid arthritis［J］.Arthritis Rheum，2002，46(11):2878－2883.

［13］Bazan JF，Bacon KB，Hardiman G，et al.A new class of membrane － bound chemokine with a CX3C motif［J］.Nature，1997，385(6617):640 －644.

［14］Yano R，Yamamura M，Sunahori K，et al.Recruitment of CD16+monocytes into synovial tissues is mediated by fractalkine and CX3CR1 in rheumatoid arthritis patients［J］.Acta Med Okayama，2007，61(2):89－98.

［15］Ruth J，Volin M，Haines K，et al.Fractalkine，a novel chemokine in rheumatoid arthritis and in rat adjuvant induced arthritis［J］.Arth Rheum，2001，44(7):1568 －1581.

［16］Volin MV，Woods JM，Amin MA，et al.Fractalkine:A novel angiogenic chemokine in rheumatoid arthritis［J］.Am J Pathol，2001，159(4):1521 － 1530.

［17］Murphy G，Caplice N，Molloy M.Fractalkine in rheumatoid arthritis:a review to date［J］.Rheumatology，2008，47(10):1446－1451.

［18］Nah SS，Won HJ，Ha E，et al.Epidermal growth factor increases prostaglandin E2production via ERK1/2 MAPK and NF－κB pathway in fibroblast like synoviocytes from patients with rheumatoid arthritis［J］.Rheumatol Int，2010，30(4):443－449.

［19］徐 波，邢 丞，李 敏，等.醛肽類蛋白酶體抑制劑對LPS誘導小鼠巨噬細胞炎癥介質表達的影響［J］.中國病理生理雜志，2009，25(5):988－992.