白血病Reh、HL－60、K562細胞系RUNX3基因P2啟動子甲基化狀態與RUNX3基因表達*

李大彩， 吳明彩， 張根葆， 畢富勇△

(皖南醫學院1腫瘤生化研究室，2病理生理學教研室，安徽 蕪湖 241002)

白血病是一種造血干細胞的惡性克隆性疾病，嚴重威脅人類健康。隨著近年來分子生物學、遺傳學等學科的發展，白血病的治療水平有了很大提高，比如急性早幼粒細胞白血病［1］，但這僅是少數特例。另外很多類型的白血病治療效果仍然不佳，預后差。RUNX3屬人runt相關轉錄因子(runtrelated transcription factor，RUNX)家族成員，RUNX3基因作為一種近年來發現的抑癌基因，已在多種實體瘤中發現其發生了異常甲基化，并且認為RUNX3基因啟動子的甲基化是導致該基因失活，促進腫瘤發生發展的重要因素。而該基因啟動子在不同白血病細胞中的甲基化狀態的研究鮮有報道。本實驗采用甲基化特異性 PCR(methylation－specific PCR，MSP)和RT－PCR方法對白血病Reh、HL－60和K562細胞系進行研究，探討白血病 Reh、HL－60和 K562細胞系中RUNX3基因P2啟動子的甲基化狀態及該基因的表達情況。

材料和方法

1 材料

1.1 主要儀器與試劑 PCR擴增儀(東勝創新生物科技有限公司);水平電泳槽、電泳儀(北京六一儀器公司);捷達801凝膠成像系統(江蘇省捷達科技發展有限公司)。DNA提取試劑盒(Promega);Epitect Bisulfite Kit(Qiagen);Trizol試劑(上海生工);PCR試劑盒(Promega);RT－PCR(Promega);RPMI－1640(上海生工);胎牛血清(Biochrom/上海生工);DNA marker(上海生工);瓊脂糖(西班牙進口);DNase 1(上海生工)。引物［2］委托上海生工合成，見表1。

表1 引物、序列及擴增長度Table 1.The primer sequence and amplification length

1.2 細胞培養 人白血病細胞系Reh購自中科院上海細胞庫(ATCC建系)，人白血病細胞系HL－60和K562由山東大學醫學院惠贈。Reh、HL－60、K562細胞于RPMI－1640培養液(含10%胎牛血清，其中Reh細胞系的培養血清為Biochrom胎牛血清，余為上海生工胎牛血清)，37℃、5%CO2、飽和濕度CO2培養箱中孵育，2－3 d傳代1次。以對數生長期的細胞為實驗細胞。

2 方法

2.1 DNA提取及MSP 取1×106細胞按DNA提取說明書(Promega)提取DNA，對提取的DNA用紫外分光光度計檢測其純度及含量，DNA純度測定:A260/A280＞1.8。取2 μg DNA按Epitect Bisulfite Kit(Qiagen)說明書進行修飾及純化，純化后的DNA立即使用或－20℃保存備用。純化后的DNA作為模板進行MSP，PCR反應體系(25 μL):2× GoTaq? Hot Start Green Master Mix 12.5 μL，Epitect Bisulfite Kit修飾后的DNA 模板 2 μL，雙蒸水 8.5 μL，引物(10 umol/L)各 1 μL。PCR反應條件:94℃預變性2 min后進行35個循環:94℃30 s，58℃ 30s，72℃ 30 s，最后1個循環后再72℃ 5min。每個樣本擴增時，同時以滅菌雙蒸水作為陰性對照。取5 μL PCR產物3.5%的瓊脂糖凝膠(含溴化乙啶)電泳，分析產物。

2.2 RNA提取及RT－PCR 取1×106細胞用 Trizol試劑(上海生工)按說明書提取RNA。用DNase1(RNA free)(上海生工)消化RNA中痕量的DNA，用紫外分光光度計及瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的含量及純度。RNA的純度測定:A260/A280＞2.0。取消化后的RNA作為模板進行RT－PCR實驗，操作按試劑盒說明書(Promega)一步法進行。RT－PCR體系為 25 μL，2 × AccessQuickTMMaster Mix 12.5 μL，RNA 模板 2 μL，Nuclease － free water 6.5 μL，引物各 2 μL，AMV Reverse Transcriptase 0.5 μL。RT－PCR反應條件為:45℃孵育45 min，95℃預變性2 min之后進行32個如下循環:95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，最后1個循環后再72℃ 5 min。同時，滅菌DEPC水作為陰性對照，GAPDH作為內參照。擴增產物3.5%的瓊脂糖凝膠(含溴化乙啶)電泳，分析擴增產物。

2.3 瓊脂糖凝膠電泳結果分析 用凝膠成像系統(捷達801)掃描電泳條帶，以RUNX3特異性擴增產物條帶吸光度值與GAPDH條帶吸光度值之比半定量分析各細胞系的基因表達水平。

3 統計學處理

結 果

1 MSP檢測

用RUNX3基因甲基化特異性引物及非甲基化特異性引物擴增修飾后的 DNA，MSP后Reh、HL－60、K562細胞系分別在甲基化特異性擴增(methylation)、非甲基化特異性擴增(unmethylation)、甲基化特異性擴增得到了預期大小的擴增片段，見圖1。提示RUNX3基因P2啟動子在Reh、K562細胞系中為甲基化狀態;而HL－60細胞系RUNX3基因P2啟動子為非甲基化的狀態。

Figure 1.The methylation status of RUNX3 gene P2 promoter in Reh，HL －60 and K562 cells.M:marker;Me:methylation－specific products;U:unmethylation－specific products;NC:negative control.圖1 MSP結果

2 RT－PCR檢測

用RUNX3基因RT－PCR特異性引物及GAPDH引物進行RT－PCR擴增，HL－60細胞RNA進行RT－PCR一步法擴增后，RT－PCR特異性引物得到了預期大小的擴增產物，見圖2，而Reh及K562細胞系RNA無RUNX3基因RT－PCR特異性引物擴增的預期大小產物。GAPDH在RT－PCR擴增時作為內參照，都有預期大小產物生成。實驗結果顯示:在Reh及K562細胞系，無RUNX3基因表達，而在HL－60細胞系有RUNX3基因的表達，見表2。

討 論

目前認為，癌基因的激活與過量表達與腫瘤形成有關，同時，抑癌基因的丟失或失活也可能導致腫瘤發生。在抑癌基因的失活或活性降低的發生過程中，抑癌基因的甲基化可能是一個重要機制。對這一問題的研究有助于我們對腫瘤發生機制的認識。

Figure 2.The expression of RUNX3 gene in Reh，HL －60 and K562 cells.M:marker;152 bp:RT－PCR product of RUNX3 gene;208 bp:RT－PCR product of GAPDH;NC:negative control.圖2 RT－PCR結果

表2 白血病Reh、HL－60、K562細胞系RUNX3 mRNA的表達Table 2.The expression of RUNX3 mRNA in Reh，HL －60 and K562 cells(.n=5)

表2 白血病Reh、HL－60、K562細胞系RUNX3 mRNA的表達Table 2.The expression of RUNX3 mRNA in Reh，HL －60 and K562 cells(.n=5)

The relative expression level of RUNX3 was normalized against the level of GAPDH.

Cell RUNX3mRNA expression Reh 0 K562 0 HL60 1.36 ±0.19

RUNX3基因為近年來發現的一個抑癌基因，該基因位于人染色體1p36.1上，含有P1、P2兩個啟動子，其中P2啟動子中CG含量高達64%。RUNX3基因編碼的蛋白質為含有415個氨基酸的RUNX3蛋白，它廣泛表達于各種類型的細胞，尤其在人消化道上皮細胞及血液細胞最為顯著［3］。RUNX3的抑癌機制被認為可能與轉化生長因子β(transforming growthfactor beta，TGF－β)的功能有關，為其下游通路的一個環節，參與細胞生長的負調控［4］。

DNA的甲基化是指在甲基轉移酶(DNA methyltransferases，DNMT)的作用下，將甲基添加到胞嘧啶(C)的5位碳原子上，轉變成5－甲基胞嘧啶。一個基因的啟動子區域CpG島異常甲基化(高甲基化)常導致該基因的表達下調或缺失。

研究發現，在多種實體瘤中，癌組織有RUNX3基因啟動子的高甲基化率，而相應正常組織RUNX3基因啟動子甲基化率低或是非甲基化的狀態。并且認為，RUNX3基因P2啟動子的甲基化是導致該基因失活、表達缺失、促進腫瘤發生發展的重要因素。

關于RUNX3基因啟動子甲基化狀態在白血病細胞系及白血病患者中的報道較少。在僅有的幾篇報道中，對一些細胞系的甲基化狀態研究方面存在矛盾的結果。白血病因類型、染色體改變、免疫表型、融合基因等不同，所采取的治療方案也不同。因此對于白血病發病機制的認識，有助于對白血病治療方案的選擇。例如作為急性髓性白血病的一個特殊類型，急性早幼粒細胞白血病針對其特殊的分子發生機制有獨特的治療方法，并且有較好的治療效果。因此對不同類型白血病發病機制的探究，將有助于白血病的治療。

在本研究中，Reh及K562細胞系，RUNX3基因P2啟動子的甲基化為陽性，RT－PCR檢測無該基因的表達;而在HL－60細胞系RUNX3基因P2啟動子的甲基化為陰性，RTPCR檢測有該基因的表達。結合Cheng等［5］的報道，用5－氮雜2’－脫氧胞苷(5－aza－2’－deoxycytidine，5－Aza)處理Reh后，RUNX3的表達恢復，這提示我們:在白血病Reh及K562細胞系，RUNX3基因P2啟動子為甲基化的狀態，P2啟動子的甲基化可能是導致該基因失活、基因表達缺失的重要因素。這個機制可能在Reh及K562細胞系所代表的急性淋巴細胞白血病及慢性髓性白血病的發病過程中起到一定作用。上述3種細胞系之間RUNX3基因表達的明顯差異(P＜0.01)可能就在于它們之間RUNX3基因P2啟動子甲基化狀態的不同。因本實驗中，急性淋巴細胞性白血病及慢性髓性白血病只分別選取了1種細胞系，不能代表該類型所有細胞系。Cheng等［5］認為在急性淋巴細胞白血病及慢性髓性白血病細胞中RUNX3基因啟動子的甲基化率分別為2/4和1/2。在白血病的發病機制中，傳統認為染色體易位、蛋白融合是一個重要的特征，而目前認為有遺傳和表觀遺傳機制的共同作用。表觀遺傳作用在腫瘤發生過程中的作用越來越被學者們所認識［6］。

RUNX3基因P2啟動子甲基化在多種腫瘤中都有發生，并且在很多實驗中發現，在癌前病變中就有該基因的失活。李文慶等［7］認為，RUNX3的表達與幽門螺桿菌感染相關胃黏膜病變程度呈明顯的負相關，病變越重表達越低。Li等［8］發現在胃黏膜的腸化生組織比正常上皮細胞的RUNX3表達明顯降低。因此提示我們RUNX3基因可作為早期診斷的分子指標。在白血病發病的高危人群，我們可以通過檢測RUNX3基因P2啟動子的甲基化狀態，進行早期診斷，以期早治療。

RUNX3基因P2啟動子甲基化狀態可作為預后診斷的因素。Araki等［9］在對肺癌病例進行分析發現，RUNX3高表達的病例5年生存率明顯高于低表達者，認為RUNX3可以作為預后診斷的因素。林東軍等［10］在研究急性白血病患者時發現，存在RUNX3啟動子區域甲基化的患者首次化療后完全緩解率低于未甲基化者，認為對RUNX3啟動子區域甲基化的檢測有助于對預后的估計。黃珍等［11］在研究兒童急性白血病時也有相同結論。因而，對于RUNX3基因P2啟動子甲基化狀態的研究有助于我們對白血病患者預后的判斷。

與遺傳學的變化不同，表觀遺傳學的修飾具有可逆性，可以通過藥物處理使其發生逆轉，使得表觀遺傳學的改變可以作為藥物治療的靶點。在一些實驗中發現，恢復RUNX3的表達，使細胞生長速度減慢，可促進細胞凋亡，抑制腫瘤生長［12］，因而也為臨床白血病的治療提供了一個新的方向。目前，已經有實驗［13］利用核苷類似物來抑制DNMT活性，達到降甲基化的目的。但同時也有學者提出了不同的看法，認為在降甲基化治療的同時，可能引起其它腫瘤發生的風險［14］。這些問題尚需要進一步研究探索。

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［11］黃 珍，高 楠，岑建農，等.Runx3基因啟動子甲基化與兒童急性白血病關系的研究［J］.中國實用兒科雜志，2009，24(9):705 －707，710.

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