野菊花提取物對慢性支氣管炎大鼠肺功能及自由基水平的影響

黃 勇 蘇 韞 明海霞 顏春魯 薛 娜 (甘肅中醫學院，甘肅 蘭州 730000)

本實驗通過現代制劑工藝技術提取野菊花有效成分，以小劑量脂多糖復制慢性支氣管炎(CB)大鼠模型，觀察野菊花提取物對各組大鼠肺功能、超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)及一氧化氮(NO)含量的影響。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF級Wistar大鼠，48只，體重(200±20)g，雌雄各半，由甘肅中醫學院科研實驗中心提供，動物實驗設施使用證號:SYXK(甘)2004-0006-0000135，實驗動物質量合格證號:SCXK(甘)2004-0006-0000401。

1.2 藥物與試劑 精制脂多糖，購自美國Sigma公司;野菊花提取物:野菊花購自甘肅中醫學院附屬醫院，提取物由甘肅中醫學院中藥制劑教研室協助提取制備;SOD、MDA、NO測試盒，南京建成生物工程研究所提供(批號20080424);喘息靈膠囊，廈門星鯊制藥有限公司，批號:070101;其他試劑均為分析純。

1.3 實驗儀器 FA-2004N型電子天平(上海精密科學儀器機械有限責任公司天平制造廠)，VIS-7220分光光度儀(北京瑞利分析儀器廠)，HH.SH.CV2型電熱恒溫水浴鍋(濟南醫療器械廠);BioLap-420F生物信號分析系統、張力傳感器:成都泰盟生物科技公司出品。

1.4 動物分組及動物模型的制備 48只Wistar大鼠，隨機分為6組:空白對照組，CB模型組，喘息靈對照組，野菊花提取物低劑量組、中劑量組、高劑量組，每組8只。各組大鼠腹腔注射烏拉坦(1.4 g/kg)麻醉后，仰臥位固定于操作臺，常規消毒，縱向切開頸部，分離皮下，暴露氣管，4號針頭穿刺氣管，正常對照組氣管注入生理鹽水200 μl，其余注入1 g/L的脂多糖 200 μl建立CB模型〔1，2〕;第8天起，正常對照組、CB模型組每日灌服等體積生理鹽水，中藥對照組灌服喘息靈膠囊0.13 g·kg－1·d－1，野菊花治療組低、中、高劑量組分別灌胃野菊花提取物0.7，1.4，2.8 g·kg－1·d－1，共 21 d。

1.5 血清及肺組織勻漿的制備 各組動物按上述方法給藥后，第22天各組大鼠股動脈取血分離血清待檢。按上述方法給藥后，將制備病理切片后左側剩余肺組織，用冰冷生理鹽水漂洗，除去血液，濾紙拭干，稱重，放入10 ml的小燒杯內。用量筒量取預冷的0.86%生理鹽水(總量相當于每個組織重量的9倍)，用移液管取2/3 0.86%生理鹽水于燒杯中，用眼科小剪剪碎組織塊(小燒杯置于冰水中)。將剪碎的組織塊倒入玻璃勻漿器中，再將剩余的1/3 0.86%生理鹽水用來沖洗殘留在燒杯中的碎組織塊，一起倒入勻漿器中進行勻漿，上下轉動研磨6 min，充分研碎，使組織勻漿化，即可制成10%組織勻漿。將勻漿以3 000 r/min離心10 min，取上清液進行標本測定。

1.6 指標觀察

1.6.1 呼吸功能檢測 藥物灌胃21 d后，大鼠稱體重用20%的烏拉坦10 ml/kg腹腔內注射麻醉，待完全麻醉后，將大鼠背位固定于手術臺上，頸部正中切口，鈍性分離氣管前組織，暴露氣管，于甲狀軟骨下方做倒“T”型切口，插入“Y”型氣管插管并固定，Y型氣管插管一端經張力換能器與BioLap-420F生物信號采集系統相連，選擇呼吸功能檢測模塊，30 Hz濾波，時間常數0.1 s，速度1 mm/s，待呼吸平穩后自動描記呼吸曲線并讀取相關指標，描記15 min后保存。在所描記呼吸曲線的開始端，中部，尾部各截取三段，測定各段的呼吸頻率，最大呼氣幅度(曲線向上的峰值)，最大吸氣幅度(曲線向下的峰值)。分別取其平均值即為該鼠的呼吸頻率，最大呼氣幅度，最大吸氣幅度。據其最大呼氣幅度與最大吸氣幅度，計算呼吸氣幅度比。

1.6.2 SOD、MDA、NO的檢測 用黃嘌呤氧化酶法測定各組大鼠血清及組織中的SOD水平;用硫代巴比妥酸法(TBA)測定各組大鼠血清及組織中的MDA含量;考馬斯亮藍法測定組織中蛋白含量，用硝酸鹽還原酶法測定血清及各組織中的NO含量，具體步驟按試劑盒說明書進行。

2 結果

2.1 野菊花提取物對大鼠呼吸功能的影響 模型組大鼠呼吸頻率、最大呼氣幅度、最大吸氣幅度、呼吸氣幅度比都比空白對照組明顯改變(P＜0.01)，呼吸頻率加快，最大呼氣幅度減小，最大吸氣幅度加深，說明造模成功。經野菊花提取物治療后，各治療組呼吸頻率減慢，最大呼氣幅度增加，最大吸氣幅度變淺，呼吸功能明顯改善(P＜0.01，P＜0.05)。見表1。

表1 野菊花提取物慢支大鼠呼吸功能檢測的影響(±s，n=8)

表1 野菊花提取物慢支大鼠呼吸功能檢測的影響(±s，n=8)

與空白對照組比較:1)P＜0.01;與模型組比較:2)P＜0.01，3)P＜0.05

NS 92±17 9.08±1.57 3.30±0.62 2.75±0.70模型組 等體積NS 115±201) 4.50±0.761) 6.00±0.541) 0.75±0.181)喘息靈對照組 0.13 98±162) 8.00±2.022) 3.46±0.772) 2.31±0.902)野菊花低劑量組 0.7 100±162) 8.00±1.062) 3.96±0.682) 2.02±0.482)野菊花中劑量組 1.4 106±203) 7.64±1.002) 4.10±0.82) 1.86±0.792)野菊花高劑量組 2.8 110±253) 6.70±1.763) 4.60±0.912) 1.45±0.933)呼吸氣幅度比空白對照組 等體積組別 劑量(g·kg－1·d－1) 呼吸頻率(次/min) 最大呼幅(μV) 最大吸幅(μV)

2.2 野菊花提取物對大鼠血清及肺組織勻漿SOD含量變化的影響 模型組大鼠血清和肺組織中的SOD活力與空白對照組比較明顯降低(P＜0.05)，野菊花提取物低劑量組大鼠肺組織中SOD活力與模型組比較無顯著性差異，其余各組與模型組比較，大鼠血清和肺組織中的SOD活力均明顯升高(P＜0.05)，且高劑量組與低劑量組比較有統計學意義(P＜0.05)。見表2。

2.3 野菊花提取物對大鼠血清及肺組織勻漿MDA含量變化的影響 與空白對照組比較，模型組大鼠血清和肺組織中的MDA水平明顯升高(P＜0.05)。與模型組比較，除野菊花低劑量組血清MDA含量無顯著性改變外，其余各組大鼠血清、肺組織MDA水平均明顯降低(P＜0.05)。見表3。

2.4 對大鼠血清及肺組織勻漿NO含量變化的影響 與空白對照組比較，模型組大鼠血清和肺組織中NO的水平明顯升高(P＜0.05);與模型組比較，野菊花中、高劑量組血清和肺組織中NO含量均明顯降低，有顯著差異(P＜0.05)。見表4。

表2 各組血清及肺組織SOD含量(±s，n=8)

表2 各組血清及肺組織SOD含量(±s，n=8)

與空白對照組比較:1)P＜0.01;與模型組比較:2)P＜0.05;與低劑量組比較:3)P＜0.05

組別 劑量(g·kg－1·d－1)血清(NU/ml)肺組織(NU/mgpro)NS 283.70 ±35.89 517.61 ±81.70模型組 等體積NS 137.15±24.681)315.44±79.851)喘息靈對照組 0.13 202.64±30.161)441.27±74.102)野菊花低劑量組 0.7 173.32±28.862) 396.22±84.05野菊花中劑量組 1.4 192.02±40.522)413.14±66.292)野菊花高劑量組 2.8 207.91±24.252)3)425.30±71.602)3)空白對照組 等體積

表3 各組血清及肺組織MDA含量比較(±s，n=8)

表3 各組血清及肺組織MDA含量比較(±s，n=8)

與正常對照組比較:1)P＜0.05;與慢支模型組比較:2)P＜0.05

組別 劑量(g·kg－1·d－1)血清(nmol/ml)肺組織(nmol/gpro)NS 5.16±1.19 10.02 ±1.72模型組 等體積NS 10.24±3.221) 15.92±4.801)喘息靈對照組 0.13 6.75±1.742) 11.25±2.472)野菊花低劑量組 0.7 8.65±1.53 12.16±3.422)野菊花中劑量組 1.4 7.70±1.412) 11.32±2.782)野菊花高劑量組 2.8 6.75±1.262) 10.80±2.482)空白對照組 等體積

表4 各組血清及肺組織NO含量比較(±s，n=8)

表4 各組血清及肺組織NO含量比較(±s，n=8)

與空白對照組比較:1)P＜0.01;與模型組比較:2)P＜0.05

組別 劑量(g·kg－1·d－1)血清(μmol/ml)肺組織(μmol/gpro)NS 10.17 ±2.58 1.58 ±0.47模型組 等體積NS 16.17±2.341) 4.68±0.691)喘息靈對照組 0.13 14.67±3.15 3.28±0.64野菊花低劑量組 0.7 14.92±3.34 3.10±0.47野菊花中劑量組 1.4 13.80±2.202) 2.37±0.542)野菊花高劑量組 2.8 11.28±1.782) 2.80±0.642)空白對照組 等體積

3 討論

隨著中國進入老齡化社會，以及慢支危險因素(吸煙、環境污染等)的增加，慢性支氣管炎的實際患病人數將會越來越多，因此，尋找安全有效的藥物對防治慢支具有十分重要的意義。本課題選用野菊花，藥用歷史悠久，野菊花性涼，味苦、辛，歸肺肝二經，清熱解毒、消散癰腫、疏風平肝之功效。分布于我國東北、西北、華北等地，野生資源比較豐富，現代醫學從化學、藥理及臨床等方面均研究證明野菊花具有抗病原微生物感染、抗炎、抗氧化等多種生理活性〔3～5〕。

本實驗呼吸功能檢測結果顯示:模型組大鼠較正常大鼠呼吸頻率加快、且高于正常值(正常值為66～114次/min〔6〕)，最大呼氣幅度顯著降低，最大吸氣幅度顯著增加，呼吸幅度比顯著減小，表明模型大鼠呼吸頻率加快，呼氣變淺，吸氣變深，說明其存在氣短，喘息，提示其氣管、支氣管黏膜有病變，符合慢支的特征，進一步證明本次實驗造模是成功的。野菊花提取物各劑量組可以改善大鼠呼吸功能(減慢呼吸頻率，增大呼氣幅度，減小吸氣幅度)，緩解其氣短，呼吸困難癥狀，作用強度方面，以大、中劑量為優。其改善呼氣功能的作用機制與其改善大鼠肺部損傷、抗炎、抗氧化有密切關系。

本實驗結果表明，采用脂多糖復制的大鼠模型由于缺氧和慢性炎癥，細胞耗氧量明顯增加，體內產生大量自由基，其血清、肺組織中MDA、NO含量較正常組明顯升高，SOD活力顯著下降(P＜0.05)，脂質過氧化反應增強。而肺部慢性炎癥又使得機體抵抗力降低，抗自由基能力減弱，抗氧化能力下降，加劇了細胞壞死和組織損傷，致使病情進一步加重，肺功能進一步減退。通過模型組與正常組的結果比較顯示，這些變化可能是慢支發生、發展的重要機理之一。而經野菊花提取物治療后，SOD水平顯著提高，MDA、NO含量明顯降低(P＜0.05)，這與文獻報道野菊花提取物具有抗氧化作用是相符的，表明野菊花提取物確具有降低脂質過氧化反應，減輕氧自由基損傷，保護肺組織的作用。

本課題前期已通過實驗證明，野菊花提取物可以改善肺組織的病理損傷，降低慢支大鼠體內TNF-α、IL-6水平及PMN的吞噬功能和呼吸爆發強度〔7，8〕，以上各方面均有可能是野菊花提取物減輕CB炎癥效應的機制。

1 馬 楠，崔德建，梁延杰，等.氣管內注入脂多糖法建立大鼠慢性支氣管炎模型〔J〕.中華結核和呼吸雜志，1999;6(22):371-2.

2 唐光華，黃啟福，姜良鐸，等.艾麻口服液對慢性支氣管炎模型大鼠氣道病理損傷的影響〔J〕.北京中醫藥大學學報，2002;25(5):26-9.

3 劉建萍.中藥野菊花的研究概況〔J〕.天津藥學，2007;19(4):66-8.

4 任愛農，王志剛，盧振初，等.野菊花抑菌和抗病毒作用實驗研究〔J〕.藥物生物技術，1996;6(4):241-4.

5 張駿艷，張 磊，金 涌，等.野菊花總黃酮抗炎作用及部分機制〔J〕.安徽醫科大學學報，2005;40(5):405-7.

6 郝光榮.實驗動物學〔M〕.第2版.上海:第二軍醫大學出版社，2005:114.

7 蘇 韞，黃 勇，李 娟，等.野菊花提取物對慢性支氣管炎大鼠TNF-α及中性粒細胞功能的影響〔J〕.中藥新藥與臨床藥理，2009;20(4):300-3.

8 黃 勇，黃亞林，蘇 韞，等.野菊花提取物對慢性支氣管炎大鼠TNF-α、IL-6含量及肺組織病理形態學的影響〔J〕.中國老年學雜志，2010;18(9):2614-6.