沙棘果油對小鼠免疫調節的實驗研究

2011-08-04 03:26:04鄒元生李新蘭

水資源開發與管理 2011年4期

鄒元生，聶勇，李新蘭

（1.高原圣果沙棘制品有限公司，北京 100037；2.河北神興沙棘研究院，石家莊 050000；3.湖北省疾病預防控制中心，武漢 430079）

國內已有大量文獻報道，沙棘籽油具有增強免疫力、抗氧化、抗突變、抗腫瘤、抗癌、保護心腦血管系統、抗炎生肌、抗潰瘍、保肝、抗衰老等廣泛保健藥理作用［1，2，3］，而沙棘果油的活性作用報道較少。沙棘果油是從沙棘果肉和果汁中提出的油液。據國外報道，沙棘果肉比其種籽中的活性成分多近三分之二，故沙棘果油中含有的活性成分也較籽油中多。沙棘果油的穩定性比籽油好，沙棘果油密封在常溫也可保存10年以上，而其種籽油只能保存1～2年［4，5］。本項目旨在研究沙棘果油對小鼠免疫調節作用，將其研制成增強免疫力軟膠囊保健食品，其結果報告如下：

1 研究材料

1.1 實驗動物

SPF級昆明種雌性小鼠，18～22g，由湖北省預防醫學科學院實驗動物中心提供。實驗動物生產許可證號：SCXK （鄂）2003－0005；實驗動物使用許可證號：SYXK （鄂）2003－0014。動物飼養室溫度為24℃～26℃，濕度為60%～80%。

1.2 樣品來源及處理

軟膠囊內容物為棕紅色油狀液體，來源于河北神興沙棘研究院，人體推薦日攝入量為3.0g/人/天。將膠囊內容物用單甘脂配制成所需濃度的混懸液，供以下試驗用。

劑量分組：按人體推薦日攝入量0.05g/kg.BW擴大10、20、30倍設置低、中、高3個劑量組，即0.5、1.0、1.5g/kg.BW，共分4個實驗組，每實驗組包括空白對照組和溶劑對照組、低、中、高劑量組，各劑量組實驗動物數為10只。免疫實驗一組進行遲發型變態反應和小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗；免疫實驗二組進行淋巴器官/體重比值測定和碳粒廓清實驗。免疫實驗三組進行ConA誘導的小鼠淋巴細胞轉化實驗；免疫實驗四組進行血清溶血素的測定和抗體生成細胞檢測。小鼠連續灌胃30d后開始試驗。各實驗組均按0.20ml/10g.BW容量經口灌胃給予。

2 試驗方法和結果

2.1 方法

2.1.1 ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞轉化試驗

無菌取脾，置于盛有適量無菌Hank’s液平皿中，用鑷子輕輕將脾磨碎，制成單個細胞懸液。經200目篩網過濾，用Hank’s液洗2次，每次離心10min（1000r/min）。然后將細胞懸浮于1mL的完全培養液中，用臺酚蘭染色計數活細胞數（應在95%以上），調整細胞濃度為3×106個/mL。將每一份脾細胞懸液分兩孔加入24孔培養板中，每孔1ml，一孔加75μL COnA液（相當于7.5μg/mL），另一孔作為對照，置5%CO2，37℃CO2孵箱中培養72h。培養結束前4h，每孔輕輕吸去上清液0.7mL，加入0.7mL不合小牛血清的RPMI1640培養液，同時加入MTT （5mg/mL）50μg/孔，繼續培養4h。培養結束后，每孔加入1mL酸性異丙醇，吹打混勻，使紫色結晶完全溶解。然后分裝到96孔培養板中，每個孔作3個平行孔，（100μg/孔）用酶標儀以570nm波長測定光密度值。

2.1.2 二硝基氟苯（DNFB）誘導遲發型變態反應（DTH）

耳腫脹法。用1%DNFB（以1：1的丙酮麻油溶液配制）致敏小鼠后，第5d再用DNFB攻擊右耳，24h后處死動物剪下左右耳殼用打孔器取下直徑8mm的耳片，稱重，以左右耳的重量之差來表示DTH的程度。

2.1.3 血清溶血素的測定

血淋法。取羊血，用生理鹽水洗滌3次，每次離心（2000r/min）10min。將壓積SRBC用生理鹽水配成2% （v/v）的細胞懸液，每只鼠腹腔注射0.2mL進行免疫。4～5d后，摘除眼球取血于離心管內，放置約1h，將凝固血與管壁剝離，使血清充分析出，2000r/min離心10min，收集血清。

凝集反應：用生理鹽水將血清倍比稀釋，將不同稀釋度的血清分別置于微量血凝實驗板內，每孔100μL，再加入100μL 0.5% （v/v）的SRBC懸液，混勻，裝入濕潤的平盤內加蓋，于37℃溫箱孵育3h，觀察血球凝集程度。根據血清凝聚程度的級別計算出抗體積數。

2.1.4 腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞試驗

半體內法。制備20%的雞紅細胞懸液；每只鼠腹腔注射1mL該懸液，30min后處死動物，將其仰位固定于鼠板上，開腹，經腹腔注入生理鹽水2mL，轉動鼠板1min，然后，吸出腹腔洗液1mL，平均分滴于2片載玻片上，37℃溫育30min；育畢用生理鹽水漂洗，晾干，以1∶1的丙酮甲醇溶液固定，4%Giemsa－磷酸緩沖液染色3min，再用蒸餾水漂洗晾干。油鏡下計數100個巨噬細胞，按下式計算吞噬率和吞噬指數：

2.1.5 小鼠碳廓清試驗

按體重從小鼠尾靜脈注入稀釋的印度墨汁（100mL/kg），待墨汁注入，立即計時。

注入墨汁后2、10min，分別從內眥靜脈叢取血20μL，并立即將其加到2mL0.1%Na2CO3溶液中。各吸0.1mL于96孔酶標板中，用酶標儀在600nm波長處測光密度值（OD），以Na2CO3溶液作空白對照。

將小鼠處死。取肝臟和脾臟，用濾紙吸干臟器表面血污，分別稱重。

以吞噬指數表示小鼠碳廓清的能力。按下式計算吞噬指數a。受試樣品組的吞噬指數顯著高于對照組，可判定該項實驗結果陽性。

2.1.6 抗體生成細胞檢測

取脫纖維的羊血，用生理鹽水洗滌3次，每次離心（2000r/min）10min，每只鼠經腹腔注射2% （v/v）SRBC 0.2mL。

將SRBC免疫4～5d后的小鼠頸椎脫臼處死，取出脾臟，放在盛有Hank’s液的小平皿內，輕輕磨碎脾臟，制成細胞懸液，經200目篩網過濾，離心（1000/min）10min，用Hank’s液洗2遍，最后將細胞懸浮在5mL RPMI1640培養液中，計數細胞，并將細胞濃度調整為5×106個/mL。

空斑的測定：將表層培養基（1g瓊脂糖加雙蒸水至100mL）加熱溶解后，放45～50℃水浴保溫，與等量 pH7.2～7.4、2 倍濃度的Hank’s液混合，分裝小試管，每管0.5mL，再向管內加50μL10%SRBC （v/v，用SA緩沖液配制），20μL 脾細胞懸液（5x106個/mL），迅速混勻，傾倒于已刷瓊脂糖薄層的玻片上，做平行片，待瓊脂凝固后，將玻片水平扣放在片架上，放入二氧化碳培養箱中孵育1.5h，然后用SA緩沖液稀釋的補體（1∶8）加入玻片架凹槽內，繼續溫育1.5h后，計數溶血空斑數。