順鉑納米載體體外抗腫瘤作用的比較研究

孫曉譯，梁文權(quán)

(1.浙江大學(xué)城市學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江杭州310015;2.浙江大學(xué)藥學(xué)院，浙江杭州310058)

目前，廣泛研究和使用的親水性藥物納米載體主要有脂質(zhì)體、納米粒、聚合膠束等。藥物載體的化學(xué)組成和物理結(jié)構(gòu)，會(huì)通過(guò)改變藥物的釋放行為［1］、粒子表面特性、與細(xì)胞膜及其它成分的相互作用力［2］、細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)途徑［3］，從而最終影響藥物的療效。面對(duì)各種可供選擇的藥物載體，如何進(jìn)行合理選擇成為人們關(guān)注的問(wèn)題。目前的研究多針對(duì)一種納米載體進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾或改變，但平行比較多種載體的研究少有報(bào)道。

順鉑是一種水溶性細(xì)胞周期非特異性抗腫瘤藥物，對(duì)于卵巢癌、肺癌、鼻咽癌、食道癌、惡性淋巴瘤、乳腺癌、頭頸部鱗癌等多種實(shí)體腫瘤均有療效［4］。但因?yàn)榇嬖谀I臟毒性、神經(jīng)毒性、骨髓抑制和胃腸道反應(yīng)等嚴(yán)重的毒副作用［5］，因此臨床應(yīng)用受到了一定的限制。目前有許多給藥系統(tǒng)，如脂質(zhì)體［6］、納米粒［7］、納米囊［8］等正處于研究和開(kāi)發(fā)之中，以期能達(dá)到在靶部位緩慢釋放藥物、減少給藥劑量和降低藥物毒性的作用。其中研究較為成熟的是順鉑脂質(zhì)體和明膠納米粒。

本研究選用順鉑作為水溶性藥物的模型藥物，以順鉑脂質(zhì)體和順鉑明膠納米粒為納米載體的研究對(duì)象，通過(guò)平行的細(xì)胞攝取、消除、內(nèi)吞抑制、體外抗腫瘤等實(shí)驗(yàn)，比較兩種納米載體在敏感細(xì)胞A549中的轉(zhuǎn)運(yùn)和抗腫瘤作用的區(qū)別與特點(diǎn)，為順鉑的載體選擇提供一定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料 順鉑(CDDP)購(gòu)自山東齊魯制藥廠;氯丙嗪(CPZ)、細(xì)胞松弛素D(CytD)、非律平Ш(Filipin Ш)購(gòu)自Sigma公司;氫化大豆磷脂(HSPC)和膽固醇由Lipoid公司提供;鉑標(biāo)準(zhǔn)液、115In標(biāo)準(zhǔn)液購(gòu)自上海晶純?cè)噭┯邢薰尽MEM培養(yǎng)基、小牛血清、胰酶和青霉素-鏈霉素雙抗試劑購(gòu)于Gibico公司。

1.2 細(xì)胞株 人肺腺癌A549細(xì)胞系從中科院上海生科院購(gòu)得。

1.3 順鉑脂質(zhì)體及順鉑明膠納米粒的制備順鉑脂質(zhì)體(CDDP-liposome)根據(jù)文獻(xiàn)［9］稍經(jīng)修改制備。65℃攪拌下溶解20 mg順鉑于2 ml生理鹽水。250 mg HSPC和50 mg膽固醇溶于乙醇后，將其滴入順鉑溶液中攪拌，保持混懸液65℃，1 h。將脂質(zhì)懸液進(jìn)行探頭超聲，趁熱過(guò)0.22 μm濾膜。濾液室溫放冷，過(guò)0.45 μm濾膜除結(jié)晶藥物。濾液于透析袋(MWCO:14 kDa)室溫透析除去游離藥物。

順鉑明膠納米粒(GPs-Pt)用兩步去溶劑法制備［7］。磁力攪拌下將丙酮滴加至4%(w/v)明膠溶液(以1 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH2.5)，納米粒懸液以0.2%戊二醛交聯(lián)過(guò)夜。明膠納米粒離心收集，并用水洗除有機(jī)溶劑及交聯(lián)劑。將制得的空白納米粒分散于1 mg/ml順鉑水溶液中，37℃振搖反應(yīng)24 h。未結(jié)合的順鉑依上法離心、水洗去除。冷凍干燥即得。

1.4 納米載體的表征 取CDDP-liposomes和GPs-Pt，用PBS稀釋至合適濃度，激光衍射粒度分析儀測(cè)定粒徑分布和表面電位。

透析法(MWCO:14 kDa)測(cè)定順鉑納米載體的體外釋放。透析液為DMEM培養(yǎng)液。37℃，75次/min振搖條件下，間隔一定時(shí)間取樣。

載藥量測(cè)定:將一定量的順鉑脂質(zhì)體或納米粒消解，按1.5項(xiàng)下處理，電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)測(cè)定含量。

1.5 Pt含量測(cè)定 取待測(cè)細(xì)胞樣本，加入115In內(nèi)標(biāo)液(1 μg/ml)50 μl，再加入 5 ml 65%HNO3，于120℃中消解。溶液近干時(shí)，加超純水5 ml，再加熱至近干。重復(fù)以上步驟，至棕色氣體消失，溶液透明清亮，最后用超純水定容至5 ml，ICP-MS 進(jìn)樣分析。

1.6 細(xì)胞攝取與消除 細(xì)胞以5×105個(gè)/孔接種，過(guò)夜。攝取時(shí)給藥濃度20 μg/ml，孵育3 h。PBS洗滌后，加內(nèi)標(biāo)，按1.5項(xiàng)下消解細(xì)胞，用于整體細(xì)胞Pt含量測(cè)定。胞內(nèi)Pt含量測(cè)定時(shí)，PBS洗滌細(xì)胞后用胰酶消化細(xì)胞，離心、洗滌并收集細(xì)胞后消解，用于ICP-MS定量。

消除實(shí)驗(yàn)前，先進(jìn)行細(xì)胞攝取。后以PBS洗去藥液，以新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞，記錄該時(shí)間點(diǎn)為消除起點(diǎn)。于一定時(shí)間點(diǎn)，胰酶消化、收集細(xì)胞。按1.5項(xiàng)下處理樣品，用于胞內(nèi)Pt含量測(cè)定。

1.7 內(nèi)吞抑制 細(xì)胞5×105個(gè)/孔接種。含內(nèi)吞抑制劑的培養(yǎng)液與細(xì)胞孵育30 min后，加入含藥載體(20 μg/ml CDDP)，繼續(xù)培養(yǎng)1 h。PBS洗滌，胰酶消化收集細(xì)胞，按照1.5項(xiàng)下消解細(xì)胞測(cè)定Pt濃度。各抑制劑濃度:50 mmol/L 2DG/0.05%NaN3，10 μg/ml CPZ，2 μmol/L CytD，1 μg/ml filipin Ш。低溫?cái)z取時(shí)，細(xì)胞預(yù)先在4℃條件下放置30 min后低溫?cái)z取1 h，其余操作同前。

1.8 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞1×104個(gè)/孔接種，過(guò)夜。加入不同濃度的藥液，培養(yǎng)72 h后，MTT法測(cè)定細(xì)胞毒性。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用方差分析或t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 納米載體表征 順鉑脂質(zhì)體和明膠納米粒的粒徑、電位及載藥量，如表1所列。體外釋放以順鉑溶液為對(duì)照，結(jié)果顯示兩種載體72 h內(nèi)藥物釋放約30%，其中脂質(zhì)體的釋放較明膠納米粒更慢(72 h，P ＜0.05，圖1)。

表1 順鉑脂質(zhì)體和順鉑納米粒的粒徑、電位和載藥量Table 1 Size，zeta potential and drug loading of CDDP-liposomes and GPs-Pt

圖1 順鉑脂質(zhì)體和順鉑納米粒體外釋放曲線Fig.1 In vitro release of CDDP solution，CDDP liposomes and GPs-Pt

2.2 細(xì)胞攝取 經(jīng)細(xì)胞攝取3 h后，納米粒組胞內(nèi)和總體細(xì)胞Pt水平均顯著高于脂質(zhì)體(P＜0.05)。但其胞內(nèi)Pt濃度低于溶液組(圖2A)。明膠納米粒細(xì)胞膜吸附能力強(qiáng)，約占細(xì)胞總量的80%。

2.3 內(nèi)吞途徑 低溫?cái)z取顯著降低了胞內(nèi)藥物含量，CPZ顯著抑制了明膠納米粒和脂質(zhì)體的細(xì)胞攝取(P＜0.05)。Filipin Ш的存在對(duì)順鉑溶液和兩種納米載體的細(xì)胞攝取均無(wú)影響。CytD減小了納米粒和脂質(zhì)體的細(xì)胞內(nèi)化，脂質(zhì)體組胞內(nèi)Pt含量減小了45%，納米粒組減小了15%(圖2B)。

2.4 細(xì)胞消除 順鉑的細(xì)胞消除動(dòng)力學(xué)曲線見(jiàn)圖3A。脂質(zhì)體組4 h內(nèi)約15%的藥物被清除出細(xì)胞，順鉑溶液消除比例相似。納米粒組胞內(nèi)Pt含量下降最多(50%)，各時(shí)間點(diǎn)的消除比例較脂質(zhì)體組均有顯著性差異(P＜0.05)(圖3B)。根據(jù)一室模型計(jì)算得各藥動(dòng)學(xué)參數(shù)如表2。脂質(zhì)體組的消除速率常數(shù)小于納米粒，k約為后者的1/3。脂質(zhì)體的胞內(nèi)滯留能力大，MRT約為20 h，與溶液組接近。

2.5 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 兩種空白載體在實(shí)驗(yàn)濃度條件下，均未發(fā)現(xiàn)明顯的細(xì)胞毒性。載藥顆粒的抗增殖作用和IC50值見(jiàn)圖4。順鉑脂質(zhì)體體外抗腫瘤活性顯著大于納米粒。

表2 順鉑細(xì)胞消除動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 2 Cellular efflux parameters for CDDP and CDDP-nanocarriers

3 討論

為保證載體可比性，我們通過(guò)調(diào)節(jié)工藝制備了粒徑、電位、載藥量、體外釋放相近的兩種順鉑載體。脂質(zhì)體和納米粒72 h累積釋放約30%，可保證后續(xù)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)過(guò)程中藥物不從或僅少量從系統(tǒng)中釋放，避免游離藥物攝取而干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖4 順鉑脂質(zhì)體和納米粒體外抗腫瘤活性(A)和IC50值(B，與順鉑溶液比較，*:P＜0.05)Fig.4 Cytotoxicity of CDDP-nanocarriers and CDDP solution towards A549 cells(A)and their IC50s(B，*:P ＜0.05 vs CDDP)

從Pt攝取結(jié)果分析，兩種納米載體均能不同程度地被細(xì)胞攝取。胞內(nèi)藥物含量以順鉑溶液為最高，兩種載體中，明膠納米粒的攝取水平較高。這主要和藥物內(nèi)化效率有關(guān)。順鉑分子是通過(guò)被動(dòng)擴(kuò)散和銅離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)入胞的［10］，而兩種納米載體的細(xì)胞攝取均受CPZ和低溫抑制，表明脂質(zhì)體和納米粒是通過(guò)相對(duì)低效的顆粒內(nèi)吞途徑入胞的。結(jié)合非律平和CytD的抑制結(jié)果，說(shuō)明clathrin介導(dǎo)的內(nèi)吞和大胞飲參與了脂質(zhì)體的內(nèi)吞，通過(guò)兩種途徑入胞的藥物各占一半。明膠納米粒主要依賴clathrin途徑入胞，少量粒子通過(guò)大胞飲內(nèi)吞。由于納米載體構(gòu)成的差異，使其內(nèi)吞途徑呈現(xiàn)出多樣性［11］，繼而影響內(nèi)化水平和胞內(nèi)傳遞過(guò)程。納米給藥系統(tǒng)的細(xì)胞膜吸附在攝取實(shí)驗(yàn)中普遍存在，吸附力強(qiáng)的粒子可在細(xì)胞表面或病變部位有更長(zhǎng)的滯留時(shí)間，有利于持續(xù)釋放藥物。本實(shí)驗(yàn)使用了胰酶消化法來(lái)處理吸附載體［12］，兩種納米載體均增加了藥物的細(xì)胞膜吸附，其中，明膠納米粒的吸附力比脂質(zhì)體更強(qiáng)，這與載體材料和細(xì)胞膜之間的親和力有關(guān)。

順鉑入胞后主要與DNA和胞漿蛋白結(jié)合，游離分子通過(guò)銅外排轉(zhuǎn)運(yùn)體ATP7A/ATP7B［13］被排出細(xì)胞。通過(guò)對(duì)消除比例的分析我們發(fā)現(xiàn)，納米粒組的藥物消除率遠(yuǎn)高于脂質(zhì)體和溶液組，后者的胞內(nèi)滯留能力更好。以一室模型擬合計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(表2)，結(jié)果顯示脂質(zhì)體的消除速率常數(shù)小于納米粒，MRT與溶液劑相當(dāng)。順鉑溶液的AUC最大，納米粒最小。這可能和載體的胞內(nèi)傳遞過(guò)程有關(guān)。納米顆粒被內(nèi)吞后，會(huì)經(jīng)過(guò)內(nèi)體、溶酶體等細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)而被消化和降解，從而導(dǎo)致載體結(jié)構(gòu)的破壞和藥物的釋放［14］。另一部分未被降解的載體顆粒則可經(jīng)回收內(nèi)體被視作異物排出細(xì)胞［15］。從載體消除實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，脂質(zhì)體可能在胞內(nèi)某些內(nèi)膜結(jié)構(gòu)中被破壞，將物理包裹的順鉑釋放出來(lái)，游離的藥物分子繼而與靶點(diǎn)結(jié)合，因此消除比例和溶液組類似。而明膠納米粒經(jīng)過(guò)交聯(lián)后在胞內(nèi)的降解時(shí)間較長(zhǎng)，小分子明膠降解片段與藥物仍然以共價(jià)鍵的方式結(jié)合，需要通過(guò)離子交換實(shí)現(xiàn)順鉑的釋放［16］。因此，GPs-Pt的緩慢釋放使順鉑分子難以及時(shí)地與胞內(nèi)靶點(diǎn)結(jié)合，而未完全降解的粒子則可能通過(guò)回收過(guò)程被清除出細(xì)胞。

從細(xì)胞攝取結(jié)果分析，順鉑明膠納米粒的內(nèi)化水平比順鉑脂質(zhì)體高。而消除動(dòng)力學(xué)結(jié)果顯示，順鉑脂質(zhì)體較順鉑明膠納米粒更利于實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)釋放和胞內(nèi)滯留。在兩種因素的相互作用下，我們用抗細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)兩種納米給藥系統(tǒng)的體外抗腫瘤活性。脂質(zhì)體和明膠納米粒的IC50值均大于順鉑溶液，這與動(dòng)力學(xué)AUC結(jié)果相符。盡管納米粒的胞內(nèi)攝取含量高于脂質(zhì)體，但后者的抗腫瘤活性顯著優(yōu)于前者。這與納米粒胞內(nèi)釋放少、消除多有關(guān)。

納米載體的包裹改變了順鉑入胞途徑和內(nèi)化水平，對(duì)后續(xù)的細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)和藥物外排均有影響。在敏感細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)體或納米粒增強(qiáng)順鉑抗腫瘤活性的趨勢(shì)，但顆粒包裹順鉑具備降低藥物毒性［17］、胞外緩釋［18］、克服多藥耐藥等優(yōu)勢(shì)［19］。在A549細(xì)胞中，順鉑脂質(zhì)體較明膠納米粒有更長(zhǎng)的胞內(nèi)滯留時(shí)間和更大的AUC，抗腫瘤活性遠(yuǎn)高于納米粒。順鉑脂質(zhì)體是更適合順鉑發(fā)揮療效的納米載體。

［1］YAN F，ZHANG C，ZHENG Y，et al.The effect of poloxamer 188 on nanoparticle morphology，size，cancer cell uptake，and cytotoxicity ［J］.Nanomedicine，2010，6(1):170-178.

［2］PEETLA C，LABHASETWAR V.Biophysical characterization of nanoparticle-endothelial model cell membrane interactions ［J］.Mol Pharm，2008，5(3):418-429.

［3］VON GERSDORFF K， SANDERS N N，VANDENBROUCKE R，et al.The internalization route resulting in successfulgene expression depends on polyethylenimine both cell line and polyplex type ［J］.Mol Ther，2006，14(5):745-753.

［4］HO Y P，AU-YEUNG S C，TO K K.Platinum-based anticancer agents:Innovative design strategies and biological perspectives［J］.Med Res Rev，2003，23(5):633-655.

［5］WERNYJ R P，MORIN P J.Molecular mechanisms of platinum resistance:stillsearching forthe Achilles＇heel［J］.Drug Resist Updat，2004，7(4-5):227-232.

［6］ARIENTI C，TESEI A，RAVAIOLI A，et al.Activity of lipoplatin in tumor and in normal cells in vitro［J］.Anticancer Drugs，2008，19(10):983-990.

［7］TSENG C L，SU W Y，YEN K C，et al.The use of biotinylated-EGF-modified gelatin nanoparticle carrier to enhance cisplatin accumulation in cancerous lungs via inhalation ［J］.Biomaterials，2009，30(30):3476-3485.

［8］BURGER K N，STAFFHORST R W，DE VIJLDER H C，et al.Nanocapsules:lipid-coated aggregates of cisplatin with high cytotoxicity ［J］.Nat Med，2002，8(1):81-84.

［9］PELEG-SHULMAN T，GIBSON D，COHEN R，et al.Characterization of sterically stabilized cisplatin liposomes by nuclear magnetic resonance ［J］.BiochimBiophysActa，2001，1510(1-2):278-291.

［10］WANG D，LIPPARD S J.Cellular processing of platinum anticancer drugs［J］.Nat Rev Drug Discov，2005，4(4):307-320.

［11］RYMAN-RASMUSSENJP，RIVIERE JE，MONTEIRO-RIVIERE N A.Variables influencing interactions of untargeted quantum dot nanoparticles with skin cells and identification of biochemical modulators ［J］.Nano Lett，2007，7(5):1344-1348.

［12］DI MARZIO L，MARIANECCI C，CINQUE B，et al.pH-sensitive non-phospholipid vesicle and macrophage-like cells:Binding，uptake and endocytotic pathway［J］.Biochim Biophys Acta，2008，1778(12):2749-2756.

［13］SAFAEI R.Role of copper transporters in the uptake and efflux of platinum containing drugs［J］.Cancer Lett，2006，234(1):34-39.

［14］DELLI CASTELLI D，DASTR? W，TERRENO E，et al.In vivo MRI multicontrast kinetic analysis of the uptake and intracellular trafficking of paramagnetically labeled liposomes［J］.J Control Release，2010，144(3):271-279.

［15］JIN H，HELLER D A，SHARMA R，et al.Sizedependent cellular uptake and expulsion of singlewalled carbon nanotubes:single particle tracking and a generic uptake model for nanoparticles［J］.Acs Nano，2009，3(1):149-158.

［16］KONISHI M，TABATA Y，KARIYA M，et al.In vivo anti-tumor effect through the controlled release of cisplatin from biodegradable gelatin hydrogel［J］.J Control Release，2003，92(3):301-313.

［17］LI X，LI R，QIAN X，et al.Superior antitumor efficiency ofcisplatin-loaded nanoparticles by intratumoral delivery with decreased tumor metabolism rate［J］.Eur J Pharm Biopharm，2008，70(3):726-734.

［18］DING D，ZHU Z，LIU Q，et al.Cisplatin-loaded gelatin-poly (acrylic acid) nanoparticles:synthesis，antitumor efficiency in vivo and penetration in tumors ［J］.Eur J Pharm Biopharm，2011，Epub ahead of print.

［19］KRIEGER M L，ECKSTEIN N，SCHNEIDER V，et al.Overcomingcisplatin resistance ofovarian cancer by targeted liposomes in vitro［J］.Int J Pharm，2010，389(1-2):10-17.