約氏瘧原蟲17XL和17XNL感染小鼠組織病理學差異研究

付雍,丁艷,周桃莉,歐倩怡,徐文岳

(第三軍醫大學基礎部病原生物學教研室,重慶 400038)

瘧疾是全球三大傳染病之一,每年有大約80萬人死于瘧疾,其中多數是5歲以下的兒童(WHO,2010)。在5種人瘧中,惡性瘧感染是導致瘧疾患者死亡的主要原因。研究惡性瘧感染引起死亡的分子機制將為我們提供新的治療策略。但是,由于受倫理學的限制,重癥瘧疾許多重大機制的發現均來自于實驗室鼠瘧動物模型的研究。

約氏瘧原蟲 17XNL(P.y 17XNL)是蘭多(Landau)[1]等1965年自中非共和國紅樹鼠(Thamnomys rutilans)體內分離獲得的一種非致死株瘧原蟲,其在J.Finerty實驗室常規傳代中突然出現致死克隆,并由此分離得到致死株約氏瘧原蟲17XL(P.y 17XL)[2]。但是,目前對兩種瘧原蟲感染致病機理還知之甚少,也沒有感染導致的組織形態學差異的實驗證據。因此,我們比較觀察了P.y 17XL和P.y 17XNL感染小鼠的原蟲率和存活率,以及感染對小鼠貧血、體重的影響和對腦部、脾臟組織結構的損傷。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與瘧原蟲感染

約氏瘧原蟲P.y 17XL株和P.y 17XNL株為本室長期保存。SPF級BALB/c小鼠(雌性,20g)由第三軍醫大學實驗動物中心提供。實驗分三組:正常對照組3只,P.y 17XL感染組和P.y 17XNL感染組各8只。感染組分別腹腔接種2×105個感染瘧原蟲P.y 17XL和P.y 17XNL的紅細胞。

1.2 原蟲血癥,貧血和體重觀測

從接種后第2天開始,每隔1 d稱取小鼠體重1次,并取感染小鼠尾靜脈血1滴制作薄血片,吉姆薩染色鏡檢計算原蟲率。貧血指標為每毫升血液中紅細胞的密度。

1.3 組織病理學觀察

原蟲接種6 d后,兩感染組各隨機挑選3只小鼠,以正常組為對照,麻醉后繼以PBS和4%多聚甲醛先后灌流固定。取出小鼠腦和脾組織,4%多聚甲醛固定24 h,脫水、石蠟包埋、選擇5um厚度連續切片,HE染色,光鏡下觀察各組織形態。

2 結果

2.1 P.y 17XL感染引起BALB/c小鼠死亡

在分別接種2×105個感染瘧原蟲紅細胞后,P.y 17XL感染組小鼠原蟲增值速度極快,在感染后4 d即達20%,6 d左右原蟲率達到80%的峰值水平,并在感染后5～9 d內引起小鼠死亡。相比之下P.y 17XNL感染組小鼠原蟲增值緩慢,在感染后9 d左右僅15%,隨后原蟲水平逐漸下降直至被清除,小鼠得以存活。

2.2 P.y 17XL感染使小鼠體重顯著下降并引起嚴重貧血

感染后,在相同的飼養條件和環境中,P.y17XL感染組小鼠隨時間的推移體型明顯消瘦,從圖2A、B中可以看出小鼠的體重和紅細胞密度均呈現急劇下降的態勢,與圖1B相比可以發現,P.y 17XL感染組小鼠的體重和紅細胞密度隨原蟲率的升高而急劇降低,在感染后原蟲率達到峰值的第6 d體重丟失接近10%并引起嚴重貧血。而P.y 17XNL感染組小鼠接種后前6 d原蟲增值緩慢,小鼠體重略有增重,在7-8 d時原蟲增長出現峰值,此時小鼠體重也相應有所下降,隨著原蟲水平逐漸降低小鼠體重也趨于平穩。紅細胞密度方面,P.y 17XNL感染組小鼠隨著原蟲的增值也會出現貧血現象,但在感染12 d后隨著原蟲的逐漸清除而開始恢復。

2.3 P.y 17XL感染瘧原蟲紅細胞粘附于小鼠腦部微血管

原蟲接種6 d后,腦部切片常規HE染色顯示(圖3):P.y 17XL感染組小鼠腦部毛細血管中發現有感染瘧原蟲紅細胞的粘附和集聚(如箭頭所示),而P.y17XNL感染組小鼠則沒有。另外在兩組感染組中沒有觀察到單核細胞在腦部微血管的浸潤。

2.4 P.y 17XL和P.y 17XNL感染對小鼠脾臟組織結構的改變

脾臟是宿主抗瘧原蟲感染的主要免疫器官,感染瘧原蟲會引起脾臟組織結構的改變,而有研究報道脾臟結構的改變將影響宿主抗感染的免疫反應[3],比如降低抗瘧原蟲特異抗體親和力等。我們對脾臟切片的觀察顯示(如圖4),與對照組相比,兩組感染組小鼠的脾臟都出現腫大的現象,并且P.y17XNL感染組小鼠脾腫大程度較P.y 17XL感染組小鼠更高,但是與P.y 17XNL感染組小鼠相比,P.y 17XL感染組小鼠脾臟白髓與紅髓邊界已經模糊不清。

3 討論

重癥瘧疾嚴重危害瘧疾患者的生命安全,典型癥狀為腦型瘧,嚴重貧血和呼吸窘迫綜合征(RDS)。了解重癥瘧疾發生的分子機制將有助于發展新的瘧疾治療手段。在本研究中,我們發現約氏瘧原蟲株P.y 17XL引起致死的原因可能與感染瘧原蟲紅細胞在小鼠腦部微血管的粘附以及引起感染小鼠貧血有關。此外,P.y 17XL感染還導致小鼠脾臟組織結構的巨大改變,可能與其抑制宿主免疫反應而促進自身增殖有關。因此,P.y 17XL可以作為一種動物模型來研究重癥瘧疾的發病機理以及瘧原蟲的免疫逃避機制。

與P.y 17XNL不同的是,感染P.y 17XL可引起實驗腦型瘧的發生,表現為感染瘧原蟲紅細胞(pRBC)在腦部微血管的粘附。另外,P.y 17XL感染引起的腦型瘧與P.bANKA有所不同,表現為感染瘧原蟲紅細胞在腦部微血管的粘附,但沒有炎癥細胞的集聚[4],這一點與惡性瘧感染更為相似。因此,這種動物模型在成熟紅細胞入侵生物學,感染瘧原蟲紅細胞在腦部微血管的粘附以及對宿主抗感染免疫反應的調節等方面比伯氏瘧原蟲ANKA(P.bANKA)更接近惡性瘧感染,所以這種動物模型可以用來深入研究腦型瘧發生的分子機制。

在瘧疾流行區,嚴重貧血是惡性瘧感染引起的并發癥之一,也是重癥瘧疾的重要特征之一。貧血的發生不僅與感染瘧原蟲快速增殖有關,而且有研究發現也與宿主的補體C3、吞噬細胞以及CD4+T細胞介導的對正常紅細胞的清除有關[5,6]。從圖1和圖2可以看出,在P.y 17XL感染時,原蟲血癥快速升高的同時伴隨著紅細胞密度急劇下降,說明感染瘧原蟲紅細胞發生溶血是導致感染小鼠嚴重貧血的主要原因。

已知P.y 17XL和P.y 17XNL對宿主免疫反應的調節存在差異,比如抗炎癥因子TGF-β的分泌時間、CD4+CD25+Treg的激活[7]以及不同的IFN-γ[8]。脾臟在抗瘧原蟲感染的免疫反應中發揮著極其重要的作用,而瘧原蟲感染將引起脾臟組織架構的改變。在本研究中,我們發現P.y 17XL和P.y 17XNL兩者感染雖然都引起小鼠脾臟腫大,但是P.y 17XL還導致脾臟紅髓與白髓邊界的破壞,反映出它們對宿主免疫反應調節的差異性。另外由于兩者具有高度相似的遺傳背景,還可以通過比較基因組學等方法鑒定P.y 17XL的致死成分及其機理。

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