抗生素對重組約氏瘧原蟲BY265株感染斯氏按蚊的影響

周桃莉,付雍,王艷艷,丁艷,譚章平,徐文岳

(第三軍醫大學基礎部病原生物學教研室,重慶 400038)

瘧疾是一種嚴重危害人類健康的熱帶傳染病。構建的約氏瘧原蟲/斯氏按蚊實驗模型不但為探討瘧原蟲與蚊相互關系,而且也為研究紅外期瘧原蟲發育機制,最終預防和阻斷瘧疾的傳播提供了重要的實驗平臺。付雍等[1]構建的表達綠色熒光蛋白的重組約氏瘧原蟲BY265-GFP為瘧疾防治機制研究提供了一種更加直觀的模型,然而與野生株約氏瘧原蟲相比,重組約氏瘧原蟲BY265-GFP感染斯氏按蚊的能力明顯下降,一定程度上限制了這一模型的應用。鑒于按蚊腸道細菌能活化按蚊天然免疫抑制瘧原蟲發育,因此,本研究觀察抗生素的聯合應用對斯氏按蚊感染重組約氏瘧原蟲BY265-GFP株的影響。

1 材料與方法

1.1 供試瘧原蟲、蚊媒和動物

約氏瘧原蟲(Plasmodium yoelii)BY265-GFP株為本室構建的基因重組瘧原蟲[1],每周用昆明株小鼠血傳1次,每5 w蚊傳1次;斯氏按蚊(Anopheles stephensi):Hor株,為本實驗室長期飼養繁殖的穩定蚊種。成蚊在24～26℃、相對濕度為70%～80%的養蚊室中飼養;雌性昆明株小鼠,清潔級,重約20 g,由第三軍醫大學實驗動物中心提供。

1.2 主要試劑

慶大霉素、青霉素、鏈霉素、新霉素、泛影葡胺(上海海普藥業)、新生牛血清和 RPMI1640培養基。

1.3 抗生素糖水的配制

首先將10%的糖水高壓滅菌,按下列配方加入抗生素:每毫升糖水含慶大霉素15 μ g 、青霉素 10 U 、鏈霉素 10 μ g 、新霉素 20 μ g 。

1.4 實驗分組

將3～4日齡斯氏按蚊隨機分成4籠,每籠約300只雌性按蚊,設實驗1組(感染前后1 d都飼糖水組),實驗2組(感染前1 d飼糖水組),實驗3組(感染后1 d飼糖水組)和對照組(飼普通糖水組)。

1.5 重組約氏瘧原蟲感染小鼠動物模型的建立

將液氮保存的紅內期重組約氏瘧原蟲感染1只昆明株小鼠,當原蟲血癥達10%以上時,摘除眼球取血并離心去除血清,用PBS將沉淀紅細胞稀釋,注射12只昆明株小鼠,每只小鼠注射200 μ l紅細胞稀釋液。3 d后查原蟲血癥,當感染小鼠內的重組約氏瘧原蟲BY265-GFP株的配子體約為1%時,供上述4組斯氏按蚊叮咬吸血,每籠隨機抽取3只小鼠供血。

1.6 斯氏按蚊卵囊的觀察和唾液腺子孢子的分離計數

卵囊的觀察:于感染后7 d用乙醚輕度麻醉蚊子,在解剖鏡下解剖蚊胃后放于顯微鏡下觀察。唾液腺子孢子的分離計數[2]:收集吸食約氏瘧原蟲感染小鼠血后16 d的斯氏按蚊(雌蚊)約300只,用乙醚輕度麻醉蚊子。去除蚊的頭腹部,將蚊的胸部組織收集于研缽中,加入少量RPMI1640培養基,研磨3 min,將研磨所得的勻漿液與30 ml的 RPMI1640培養基混合,移入50 ml離心管內,4℃,300 g離心5 min。將上清液(含子孢子)移至另一50 ml離心管內,4℃,16 000 g離心10 min。棄去上清液,加入RPMI1640培養基2 ml重懸子孢子沉淀。用60%泛影葡胺、新生牛血清和RPMI1640培養基配制密度梯度離心液,取子孢子重懸液1 ml加入密度梯度離心液上面,水平離心,4℃,16 000 g離心10 min。用1 ml注射器從雙層梯離心液界面吸取富含子孢子層,加入RPMI1640培養基30 ml,4℃,16 000 g離心10 min。棄去上清液,用RPMI1640培養基1 ml重懸子孢子沉淀,在改良血細胞計數板上計數。

2 結果

2.1 抗生素對斯氏按蚊卵囊感染率的影響

吸血感染后7 d解剖斯氏按蚊中腸,對照組共解剖86只,卵囊陽性的 45只,感染率為 52.3%(有卵囊蚊數/檢查蚊數),實驗1組解剖90只,卵囊陽性的89只,感染率為98.9%,實驗2組解剖90只,卵囊陽性的88只,感染率為97.8%,實驗3組解剖90只,卵囊陽性的48只,感染率為53.3%。以上結果說明在感染前加飼抗生素對斯氏按蚊感染瘧原蟲的卵囊發育有明顯促進作用,大大提高了按蚊的感染率,而在感染后加飼抗生素是沒有作用的。

圖1 感染前后加飼抗生素組蚊胃卵囊 圖2 對照組蚊胃卵囊Fig.1 oocyst of the antibiotic-treated group Fig.2 oocyst of the control group

2.2 抗生素對斯氏按蚊唾液腺子孢子數量的影響

在吸血感染后16 d,采用密度梯度離心法分離唾液腺子孢子,對照組和實驗各組收集100只感染蚊,分離后用細胞計數板計數(結果見表2),對照組為5.4×105,實驗1、2組均明顯高于對照組的子孢子數,而實驗3組與對照組差別不大,說明在感染前加飼抗生素可明顯提高唾液腺子孢子的數量,而在感染后加飼抗生素對唾液腺子孢子的數量沒有影響。

表1 抗生素對斯氏按蚊中腸感染率的影響Tab.1 Effect of antibiotic on infection rate of oocyst in Anopheles stephensi

表2 抗生素對唾液腺子孢子數量的影響Tab.2 Effect of antibiotic on sporozoite quantity in Anopheles stephensi

3 討論

瘧原蟲發育及其致病機理的研究是制定有效瘧疾防治手段的前提。由于受研究模型的限制,相對于紅內期瘧原蟲而言,紅外期和蚊期瘧原蟲的研究相對滯緩。瘧原蟲感染按蚊模型不但有助于我們研究瘧原蟲在按蚊體內的發育機制,而且可為紅外期瘧原蟲的研究提供重要的子孢子來源。另外,由于瘧原蟲在按蚊體內進行有性生殖,因此瘧原蟲感染按蚊模型還可為瘧原蟲之間的雜交以及瘧原蟲致死遺傳分析提供重要的平臺。

斯氏按蚊是瘧疾重要的傳播媒介,約氏瘧原蟲/斯氏按蚊是目前公認的重要模型。溫度是瘧原蟲在蚊體內發育中的關鍵性因素[3],楊松、張健等[4-7]證實斯氏按蚊絲氨酸蛋白酶基因、前酚氧化酶及酚氧化酶、T EP1基因與約氏瘧原蟲卵囊黑化有關,可影響按蚊體內卵囊的發育。研究發現,雌蚊中腸是瘧原蟲在蚊體內發育的重要場所,當中腸的環境改變時,對瘧原蟲的發育會產生影響[8-10]。近年來的研究發現,按蚊的中腸通常含有多種細菌,而細菌的存在可能通過活化按蚊的天然免疫反應,抑制瘧原蟲在蚊體內的發育。約氏瘧原蟲BY265/斯氏按蚊是本室的常用模型,斯氏按蚊的瘧原蟲感染率和感染度通常很高。重組約氏瘧原蟲BY265-GFP株是我室構建的能在瘧原蟲整個生活史持續發綠色熒光的重組瘧原蟲,可為我們研究瘧原蟲在蚊體內的發育提供更加直觀的模型,然而可能由于外源基因的插入,構建的重組約氏瘧原蟲BY265-GFP株對斯氏按蚊的感染率和感染度卻較低,從而影響了此模型在科學研究中的應用。鑒此,本研究在加飼聯合抗生素的情況下,分別觀察了對斯氏按蚊中腸感染率和感染度、唾液腺子孢子數量的影響,以優化重組約氏瘧原蟲BY265-GFP株/斯氏按蚊模型。結果發現,抗生素對斯氏按蚊感染重組約氏瘧原蟲BY265-GFP株的卵囊和子孢子形成的影響明顯。我們認為適當的加飼抗生素能提高斯氏按蚊對重組約氏瘧原蟲BY265—GFP株的感染率,有助于對這一模型更好的應用,并為進一步研究瘧原蟲在宿主體內的發育和感染提供依據。

[1]付雍,丁艷,周桃莉.蚊期和紅內期持續表達綠色熒光蛋白的重組約氏瘧原蟲[J].中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志,2009,27(6):488-491.

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[6]Zhang J,Huang FS,Xu WY,et al.Plasmodium yoelii:correlation of TEP1 with mosquito melanization induced by nitroquine[J].Experimental Parasitology,2011,127(1):52-57.

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