血紅蛋白在二氧化鈦球腔陣列上的直接電化學(xué)研究

周 宇，周麗娟，孫 磊，尹 凡

（常熟理工學(xué)院 化學(xué)與材料工程學(xué)院，江蘇 常熟 215500）

0 引 言

氧化還原蛋白在電極上的直接電化學(xué)研究對(duì)了解生命體系的能量轉(zhuǎn)換和物質(zhì)代謝，了解生物大分子的結(jié)構(gòu)和物理化學(xué)性能的關(guān)系，探索蛋白質(zhì)和酶等生物大分子在生命體內(nèi)的生理作用和機(jī)制，開發(fā)新型的生物電化學(xué)傳感器等方面的應(yīng)用都具有重要的理論意義[1].

血紅蛋白（Hb）是以血紅素為輔基的蛋白質(zhì)，由于具有重要的生理功能和典型的蛋白質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)且價(jià)格低廉，是研究酶和蛋白質(zhì)直接電子轉(zhuǎn)移的理想分子.Hb電活性中心血紅素被包埋于肽鏈內(nèi)部，并且直接吸附在電極表面的蛋白質(zhì)易使固體電極表面鈍化，導(dǎo)致Hb與電極直接交換電子較為困難，難以形成有效的電流響應(yīng)信號(hào)，其電化學(xué)研究受到極大限制[2].為實(shí)現(xiàn)血紅蛋白等酶蛋白質(zhì)在電極表面發(fā)生可逆或準(zhǔn)可逆的直接電子轉(zhuǎn)移，許多研究者在電極表面修飾納米金屬[3]、納米金屬氧化物[4]、碳納米管[5]等納米材料活化Hb氧化還原中心，實(shí)現(xiàn)Hb在電極表面的電子傳遞，研究Hb在電極表面的直接電化學(xué)及在生物傳感器方面的應(yīng)用.

微電極由于具有納米材料的表面效應(yīng)、量子尺寸效應(yīng)、量子隧道效應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)酶電極的電子傳遞具有促進(jìn)作用，并且在傳質(zhì)過程中，電活性物質(zhì)從本體溶液到電極表面的擴(kuò)散由平面擴(kuò)散變?yōu)閺较驍U(kuò)散，其傳質(zhì)情況獲得了改善，電子傳遞速率加快；同時(shí)，由于微電極有效面積的減小也有效地降低充放電電流，從而提高電流信號(hào)的信噪比[6]，有效降低電化學(xué)的檢測(cè)下限.微電極陣列由多支微電極并聯(lián)組成，它很好地保持了微電極的特點(diǎn)，且可有效放大響應(yīng)電流，可以在常規(guī)儀器上獲得滿意的電化學(xué)信號(hào)而受到越來越多的研究者關(guān)注.夏興華[7]制備了納米金球腔微電極陣列，研究Hb在納米金球腔陣列上的直接電化學(xué)和對(duì)H2O2的電催化，池曉雷制備了氧化鋅（ZnO）球腔微電極陣列，將Hb吸附在ZnO球腔陣列上制備了H2O2傳感器.我們利用LB技術(shù)和溶膠-凝膠法制備二維有序TiO2球腔陣列，研究Hb在TiO2球腔陣列上的直接電化學(xué)及對(duì)H2O2的電催化性能.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

血紅蛋白（Hb）購于Sigma公司.鈦酸丁酯（Ti（OBu）4）、無水乙醇、乙酸乙酯、濃鹽酸、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀購于上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，均為分析純.ITO玻璃電阻小于100Ω（蘇州板硝子電子有限公司）.實(shí)驗(yàn)中所用水均為二次蒸餾水.

Langmuir槽（612D型，英國NIMA）；2xz-2型旋片式真空泵（上海儀表集團(tuán)供銷公司）.

1.2 ITO電極的處理及PS小球陣列的制備

利用乳液聚合法制備PS微球，粒徑約為1500nm.利用LB技術(shù)制備PS微球模板[8]，模板尺寸為0.5cm×0.4cm.

1.3 Hb/TiO2球腔陣列/ITO電極的制備

將0.2mL Ti（OBu）4+0.2mL HCl與12mL乙醇混合置于燒杯甲中超聲振蕩30min，將0.2mL水與12mL乙醇混合置于燒杯乙中超聲振蕩30min后，用滴管將混合液緩慢加入燒杯甲中，超聲振蕩30min，獲得無色透明TiO2溶膠.

將PS小球陣列/ITO電極水平放置在制備好的TiO2溶膠液中，在真空干燥器中抽真空8min后，使小球與電極之間的空隙處于真空狀態(tài)，當(dāng)體系恢復(fù)正常壓力時(shí)，前軀體溶膠填注到PS小球與電極之間的空隙內(nèi).取出修飾有TiO2溶膠的電極于室溫中靜置24h，溶膠在小球間隙結(jié)構(gòu)中緩慢反應(yīng)生成凝膠，用乙酸乙酯溶解掉PS微球，獲得凝膠骨架結(jié)構(gòu).將電極于馬弗爐中以5℃/min的升溫速率升至500℃下恒溫3h，隨爐降至室溫，得到“小碗”狀TiO2球腔陣列/ITO電極（0.5×0.4cm）.

將3mg Hb溶于1mL磷酸鹽緩沖溶液中（PBS，0.1mol/L，pH7.0），配成3g/L Hb溶液，取50μL Hb溶液直接滴加在TiO2球腔陣列表面，于4℃過夜，使其牢固吸附在TiO2球腔內(nèi)部.未覆蓋球腔陣列的ITO電極表面涂覆石蠟，以避免裸露ITO電極對(duì)陣列電極電化學(xué)測(cè)試的影響.

1.4 電化學(xué)測(cè)試方法

在CHI660c電化學(xué)工作站（上海辰華儀器有限公司）上進(jìn)行電化學(xué)測(cè)定.采用三電極電化學(xué)體系，以飽和甘汞電極（SCE）為參比電極，鉑片（2×7mm）電極為輔助電極，修飾ITO電極為工作電極（0.5×0.4cm）.測(cè)試溶液pH值均選用7.0.

2 結(jié)果與討論

2.1 TiO2陣列制備原理

溶膠-凝膠法是通過金屬-非金屬醇鹽[M（OR）n]的水解和縮聚反應(yīng)來制備金屬-非金屬氧化物的，溶膠-凝膠法制備TiO2反應(yīng)機(jī)理如下：

醇解反應(yīng)

鈦酸丁酯在水解的同時(shí)還進(jìn)行以下縮聚反應(yīng)，即發(fā)生了失醇水解和失水水解，如式（3）所示：

縮聚反應(yīng)

最終形成的凝膠結(jié)構(gòu)由式（3）決定.在溶膠向凝膠轉(zhuǎn)變的后期，生成的TiO2溶膠分子相互之間進(jìn)一步縮聚，并脫去H2O分子或醇分子構(gòu)成三維網(wǎng)絡(luò)狀醇凝膠—（TiO2）n—[9].

將修飾有PS小球模板的ITO電極水平浸入溶膠中，通過在該電極表面施加負(fù)壓，使小球與模板空隙中的空氣排出.當(dāng)體系恢復(fù)常壓時(shí)，溶膠即填充到小球的空隙中.隨著乙醇的揮發(fā)，溶膠即在空隙中形成凝膠.用乙酸乙酯溶去PS小球高溫煅燒后即形成高度有序的TiO2球腔陣列.

2.2 TiO2球腔陣列的SEM表征及直接電化學(xué)

圖1 TiO2球腔陣列SEM圖

圖1為TiO2球腔陣列的SEM圖.由圖可見，獲得的TiO2球腔陣列二維有序性良好，呈“蜂巢”結(jié)構(gòu)緊密排列，白色的TiO2球腔壁厚實(shí)飽滿，形成穩(wěn)定有序的球腔骨架結(jié)構(gòu)，相鄰球腔中心間距約1500nm，與PS小球的直徑相當(dāng).這說明利用Langmuir技術(shù)制備的PS小球模板的二維有序性良好.將修飾有PS小球的ITO電極水平放置在TiO2溶膠液中抽真空，當(dāng)回復(fù)到常壓后，TiO2溶膠液被壓入PS小球間隙中，溶膠依托PS小球間隙結(jié)構(gòu)聚合交聯(lián)形成凝膠，通過融蝕模板小球即能獲得具有良好二維有序性的球腔陣列；同時(shí)只要變換PS小球尺寸，小球間隙尺寸也相應(yīng)發(fā)生改變，從而能達(dá)到自由地控制球腔陣列尺寸的目的.

2.3 TiO2球腔陣列/ITO電極的電化學(xué)特性

TiO2球腔/ITO電極在含有0.1mol/L KCl的1mmol/L K3[Fe（CN）6]溶液中的CV曲線見圖2（A）. 與裸ITO電極相比，TiO2球腔/ITO電極的氧化-還原峰電流明顯減小，這是因?yàn)樵贗TO電極上修飾了一層致密的TiO2球腔陣列膜，它增大了探針分子[Fe（CN）6]3-/4-與ITO電極之間的電子傳遞阻力.TiO2球腔/ITO電極電阻的大小與凝膠層的厚度相關(guān).TiO2是一種優(yōu)良的半導(dǎo)體材料，由于受PS小球間隙結(jié)構(gòu)的限域作用影響，TiO2球腔邊緣處凝膠層最厚，底部的凝膠層最薄，因而球腔底部導(dǎo)電性最好，電化學(xué)反應(yīng)優(yōu)先在球腔底部發(fā)生.

與單個(gè)微電極的擴(kuò)散方式不同，待測(cè)物質(zhì)在TiO2球腔陣列上的擴(kuò)散類型與擴(kuò)散層厚度δ、相鄰電極中心間距d、掃描速率v有關(guān).TiO2球腔陣列擴(kuò)散類型圖見圖2B.在掃描速率較低的情況下，δ較大，相鄰電極之間的擴(kuò)散層發(fā)生交疊，在此情況下，CV曲線出現(xiàn)峰型電流，且峰電流隨掃描速率v的增加而變大.隨著掃描速率的增大，δ逐漸變小，當(dāng)δ≤d/2時(shí)，相鄰電極的擴(kuò)散層相互獨(dú)立，待測(cè)物質(zhì)在電極表面擴(kuò)散類型為徑向擴(kuò)散，此時(shí)CV峰電流為各個(gè)微電極極限電流之和，在一定范圍內(nèi)，CV峰電流大小與掃描速率無關(guān).隨著掃描速率繼續(xù)增大δ繼續(xù)變小，當(dāng)δ＜＜d/2時(shí)，待測(cè)物質(zhì)在單個(gè)微電極上的擴(kuò)散類型轉(zhuǎn)變?yōu)榫€性擴(kuò)散，此時(shí)CV曲線峰電流受擴(kuò)散控制，隨掃描速率的增加而變大[10，11].

通過不同掃描速率考察TiO2球腔/ITO電極的擴(kuò)散類型（圖2B），掃速由內(nèi)到外分別為50mV/s、100 mV/s、150mV/s、200mV/s、250mV/s、300mV/s、350mV/s、400mV/s、450mV/s、500mV/s、700mV/s、1000mV/s. 當(dāng)掃描速率低于100mV/s時(shí)，CV曲線開始出現(xiàn)常規(guī)電極的傳統(tǒng)峰形，當(dāng)掃描速率由50mV/s增大到100mV/s時(shí)，還原峰電流隨掃描速率增大而增幅較大，這是由于TiO2球腔陣列中相鄰微電極的擴(kuò)散層發(fā)生擴(kuò)散交疊所造成的，此時(shí)電極擴(kuò)散類型為交疊的徑向擴(kuò)散.當(dāng)掃描速率≥100mV/s時(shí)，CV曲線均為“S”形，還原峰電流隨掃描速率增大變化不大.隨著掃描速率的增大，擴(kuò)散層厚度變小，此時(shí)相鄰微電極的擴(kuò)散層相互獨(dú)立，擴(kuò)散類型徑向擴(kuò)散，電子與電極之間傳遞速率最快，電極信噪比最大.當(dāng)掃描速率＞500mV/s時(shí)，還原峰電流隨掃速增大影響較大，擴(kuò)散開始向線性擴(kuò)散轉(zhuǎn)變.因此，可認(rèn)為TiO2球腔陣列/ITO電極具有微電極陣列的特性，但由于球腔的限域作用，球腔陣列的擴(kuò)散和經(jīng)典柱狀微電極陣列的擴(kuò)散略有不同，兩者CV曲線也略有差別.

2.4 Hb/TiO2球腔陣列/ITO電極的直接電化學(xué)

圖2 （A）不同電極的CV曲線，掃速100mV/s（B）TiO2球腔陣列擴(kuò)散類型圖（C）不同掃速下TiO2球腔陣列/ITO電極的CV曲線.溶液0.1mol/L KCl+1mmol/L K3[Fe（CN）6]

圖3 不同電極在0.1mol/L PBS緩沖液（pH7.0）的CV曲線.掃描速率為100mV/s

在pH7.0的PBS溶液中采用CV法考察不同修飾電極上的直接電化學(xué)，見圖3.由圖可見，TiO2球腔陣列/ITO電極在PBS溶液中幾乎無電化學(xué)響應(yīng).直接吸附Hb的ITO電極CV曲線無明顯的氧化還原峰，這可能是因?yàn)镠b在ITO電極表面發(fā)生了吸附變性，阻礙了Hb活性中心與電極之間的直接電子轉(zhuǎn)移.難以形成有效的電流響應(yīng)信號(hào).在Hb/TiO2球腔陣列/ITO電極的CV曲線中可見一對(duì)幾乎可逆的氧化還原峰，其氧化峰電位（Epa）和還原峰電位（Epc）分別為0.042V和0.127V，峰電位差為85mV，式量電位（E0`）為 0.0845V，這與Nadzhafova[12]等報(bào)道的式量電位0.084V相近.Hb/TiO2球腔陣列/ITO電極具有良好的電化學(xué)響應(yīng)，這是因?yàn)槲⑶蚯魂嚵芯哂休^大的比表面積，球腔特殊的“半包含”結(jié)構(gòu)能更好地吸附Hb；高溫煅燒后的TiO2薄膜本身就具有較好的親水性，球腔多孔的存在增加了薄膜的表面能，更增強(qiáng)了其親水性能，這為保持Hb的活性提供了優(yōu)良的微環(huán)境，對(duì)Hb與電極的電子轉(zhuǎn)移具有促進(jìn)作用.上述因素的綜合，使Hb在保持其電化學(xué)活性的同時(shí)，更容易與電極之間發(fā)生電子傳遞，提高了電極的電流響應(yīng).

2.5 Hb/TiO2球腔陣列/ITO電極與掃速的關(guān)系

Hb/TiO2球腔陣列/ITO電極峰電流與掃描速率的關(guān)系見圖4A，掃描速率由內(nèi)而外依次為：50mV/s、100mV/s、150mV/s、200mV/s、250mV/s、300mV/s、350mV/s、400mV/s、450mV/s、500mV/s. 隨著掃描速度的增加，氧化還原峰電流也隨之增加，峰電位略有移動(dòng)，在50mV/s～500mV/s范圍內(nèi)，峰電流與掃速成正比，其線性方程分別為Ipa（μA）=1.361+0.01286υ（mV/s），R為0.997；Ipc（μA）=-1.583-0.0174υ（mV/s），R為-0.996，表明電極反應(yīng)為表面控制[13].根據(jù)Laviron模型[14]，由Ks=mFnv/RT（m是與峰電位差值有關(guān)的常數(shù)），求得直接電子轉(zhuǎn)移速率常數(shù)為2.97s-1.與文獻(xiàn)值[15]血紅蛋白在二氧化鈰修飾電極上電子轉(zhuǎn)移速率常數(shù)0.68s-1，血紅蛋白在離子液體[BMIM]PF6碳糊電極上[16]的電子轉(zhuǎn)移速率常數(shù)0.149s-1相比，采用本方法固定的Hb具有較大的直接電子轉(zhuǎn)移速率，電化學(xué)活性良好.

2.6 Hb/TiO2球腔陣列/ITO電極對(duì)H2O2的電催化

圖4 不同掃描速率Hb/TiO2球腔陣列/ITO電極CV圖（0.1mol/L PBS，pH7.0）

Hb/TiO2球腔陣列/ITO電極在0.1mol/L PBS（pH7.0）溶液中對(duì)H2O2的電催化見圖5.加入H2O2后，氧化峰電流隨著加入量的增加明顯減小，而還原峰電流逐漸增加，說明Hb/TiO2球腔陣列/ITO電極對(duì)H2O2具有良好的電催化活性，可作為測(cè)定H2O2含量的生物傳感器.

2.7 Hb/TiO2球腔陣列/ITO電極對(duì)工作電位的選擇

在不同的工作電位下，修飾于TiO2球腔陣列上的Hb對(duì)H2O2的電流響應(yīng)也不同.圖6為不同工作電位下，修飾電極對(duì)H2O2的電流響應(yīng)曲線.在含有0.1mmol/L H2O2的PBS（pH7.0）溶液中，工作電位在0.2V到－0.5V的范圍內(nèi)，隨工作電位負(fù)移，響應(yīng)電流增大.考慮到工作電位越負(fù)，電活性物質(zhì)的干擾性越強(qiáng)，而在－0.3V電位下基線電流較小，能有效地減少溶液中電活性物質(zhì)的干擾，故我們選擇工作電位為－0.3V.

2.8 Hb/TiO2球腔陣列/ITO電極的I-T曲線

以Hb/TiO2球陣列/ITO電極為工作電極，在0.1mol/L PBS（pH7.0）溶液中連續(xù)加入一定量的H2O2使其濃度依次遞增，得到計(jì)時(shí)電流響應(yīng)曲線（圖7A）.由圖可見，加入H2O2后響應(yīng)電流隨即增大，約在6秒內(nèi)達(dá)到平衡，說明該電極對(duì)加入的H2O2響應(yīng)快速.響應(yīng)電流與其濃度在9.00×10-7～4.44×10-4mol/L內(nèi)呈線性關(guān)系，線性方程為 Ipa（μA）=0.0443+2.558C（mmol/L），R為0.9995（圖7B），檢出限為 3.12×10-7mol/L（S/N=3）.采用lineweaver-burk方程：

式中，Iss是加入底物后測(cè)得的穩(wěn)態(tài)電流，C為底物濃度，Imax是加入飽和底物后測(cè)得的最大電流.求得Hb對(duì)H2O2催化的米氏常數(shù)為0.138mmol/L，該值小于Ma[17]等報(bào)道的Hb修飾在聚3羥基丁酸薄膜上的米氏常數(shù)1.076mmol/L和羅曉紅[18]等報(bào)道的Hb修飾在殼聚糖碳納米管上的米氏常數(shù)1.400mmol/L，表明了以本方法固定的Hb對(duì)H2O2具有較強(qiáng)的親和力.

2.9 Hb/TiO2球腔陣列/ITO電極的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性

圖5 Hb/TiO2陣列/ITO電極在0.1mol/LPBS（pH7.0）溶液中于不同濃度下H2O2的CV圖（掃描速率100mV/s）a：無H2O2；b：0.93mmol/L；c：1.63mmol/L

圖6 Hb/TiO2球腔陣列/ITO電極在不同工作電位下對(duì)H2O2的電流響應(yīng)

圖7 （A）Hb/TiO2球腔陣列/ITO電極在0.1mol/L的PBS（pH7.0）溶液中對(duì)連續(xù)加入的H2O2的安培響應(yīng)（工作電位：-0.30V）（B）電流響應(yīng)與H2O2的關(guān)系曲線圖

將Hb/TiO2球腔陣列/ITO電極于0.1mol/L PBS（pH7.0）中，選擇掃描速率為100mV/s，連續(xù)100圈CV掃描，考察修飾電極的穩(wěn)定性.結(jié)果表明：100圈掃描后的CV圖中峰電流、峰電位、峰間距幾乎沒有變化.Hb/TiO2球腔陣列/ITO電極在濃度為0.5mmol/L H2O2平行測(cè)定10次，CV還原峰電流相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.3%.所制備的傳感器在4℃的冰箱中保存7天后測(cè)定，響應(yīng)電流為初始電流的96.3%，放置21天后，響應(yīng)電流為初始電流的87.0%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Hb修飾TiO2球腔微電極陣列重現(xiàn)性和穩(wěn)定性良好且具有較長的使用壽命.

3 總 結(jié)

本文利用sol-gel法制備了二維有序性良好的TiO2球腔陣列，通過循環(huán)伏安法研究表明該陣列具有微電極陣列的特性.利用吸附法將Hb直接固定在TiO2球腔陣列/ITO電極上，研究酶在修飾電極上的電化學(xué)活性和對(duì)H2O2的電催化活性.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：由于TiO2的親水性環(huán)境能很好地保持蛋白質(zhì)的生物活性，球腔陣列所具有的特殊的網(wǎng)狀球腔結(jié)構(gòu)具有更大的比表面積，能有效提高電極表面蛋白質(zhì)的負(fù)載量，并且，TiO2球腔陣列所具有的微電極特性極大改善了蛋白質(zhì)在電極表面的傳質(zhì)過程，提高了電流信號(hào)的信噪比.Hb/TiO2球腔陣列/ITO對(duì)H2O2的電催化快速靈敏，具有較低的檢出限，催化電流在一定范圍內(nèi)與H2O2濃度呈線性關(guān)系，為構(gòu)建電流型H2O2生物傳感器提供了一種方法.

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