赤眼鱒Myf5基因的克隆、序列和表達分析

嚴婷婷，邵 芳，王 野，盧祥云，顧志良

（常熟理工學院 生物與食品工程學院，江蘇 常熟 215500）

生肌調節因子（MRFs）基因家族的表達決定著肌細胞的命運，并控制其增殖和分化.它與肌纖維的數量、大小有著密切的關系，因而對肉質和風味有非常重要的作用.生肌調節因子MRFs基因家族編碼4種不同的轉錄因子，分別為生肌決定因子MyoD、肌細胞生成素Myogenin（MyoG）、生肌因子5（Myf5）、生肌調節因子4（MRF4），它們是各自或協同調控骨骼肌生成的關鍵因子［1］.

生肌因子Myf5是該家族中最早表達的基因，在成肌細胞的特化與增殖過程中發揮關鍵作用，Myf5基因敲除實驗中小鼠軸上肌肉系統發育遲緩并死于肋骨缺陷癥，說明Myf5基因起始調控了軸上肌肉的形成［2］.此外，缺乏MyoD和Myf5的小鼠不能形成肌肉，沒有肌肉標志（Marker）出現，在胚胎時期阻礙斑馬魚Myf5基因的表達，體節形成與肌肉發育過程均表現出異常［3］，說明魚類的Myf5基因與哺乳類有著相似的功能.生肌因子Myf5的研究對揭示魚類肌肉生長發育調節因子功能具有重要意義.如今，Myf5基因已經在多種哺乳動物中被鑒定克隆出來，如小鼠、牛、豬、綿羊、雞等，但在魚類中研究較少，目前只在斑馬魚、條紋鱸、花鱸、褐牙鲆中克隆出基因組序列；在紅鰭東方鲀、大西洋鮭、虹鱒、鯉、鯪和大口黑鱸中得到cDNA序列［4,5］.

赤眼鱒（Squaliobarbus curriculus）屬鯉形目，鯉科，雅羅魚亞科，赤眼鱒屬.頭呈圓錐形，吻鈍，口呈弧形.外形酷似草魚，唯眼上半部具紅色斑而得名.我國除青藏高原外，各大小江河及湖泊均產，國外見于朝鮮及越南.在天然水體中分布廣，是野生名優淡水魚品種之一，肉質細嫩，營養豐富，經濟價值高，受消費者歡迎.目前對赤眼鱒的養殖技術研究廣泛，但其基因水平的研究甚少，還沒有赤眼鱒Myf5基因組全序列的報道.本實驗采用RT-PCR方法，獲得赤眼鱒Myf5基因部分序列，并檢測不同組織中Myf5基因的表達情況.填補了赤眼鱒Myf5基因的研究空白，有助于進一步了解赤眼鱒Myf5基因表達與調控的分子機制.為今后赤眼鱒的資源保護、開發和養殖提供相應的理論依據.

1 材料與方法

1.1 實驗動物及總RNA提取

表1 本研究所用引物

赤眼鱒由蘇州市長江水產繁育工程研究中心提供，活魚宰殺后，采集其肌肉、肝臟、腸和腦等8種組織，液氮速凍后于-80℃冰箱中保存.采用Trizol（Invitrogen，USA）分別提取上述組織的總RNA，保存于-80℃冰箱備用.

1.2 引物的設計和合成

根據GenBank已公布的鯉科魚類的Myf5序列設計引物擴增赤眼鱒的Myf5基因.引物由上海生工生物工程有限公司合成.（見表1）.擴增赤眼鱒β-actin基因的引物為CaBactinF/caBactinR.

1.3 RT-PCR

反轉錄按TaKaRa反轉錄試劑盒（TaKaRa RNA PCR Kit Ver.3.0.）要求進行，反應體系為2μL MgCl2（25mmol/L），1μL 10×RT Buffer，1μL dNTP Mixture（各 10mmol/L），0.25μL RNase Inhibitor，0.5μL AMV Reverse Transcriptase，0.5μL Random 9 mers，1μg總RNA，加RNAseFree超純水至總反應體積為10μL. 反應程序為：30℃ 10min；42℃ 30min；99℃ 5min；5℃ 5min.以合成的cDNA為模板和引物Zfmyf5F1/R1擴增赤眼鱒 Myf5基因 350bp片段，反應體系為 10×PCR buffer 2.5μL，10mmol/L dNTPs 2μL，10μmol/L引物Zfmyf5F1/R1各1μL，rTaq（5U/μL）0.2μL，1μL cDNA，ddH2O 17.3μL.PCR程序為：94℃ 5min；94℃ 30 sec，56℃ 30sec，72℃ 1min，共35個循環；72℃ 8min；4℃保溫.PCR產物在1%瓊脂糖凝膠中電泳，并回收克隆后測序.

1.4 不同組織mRNA表達的RT-PCR檢測

RT-PCR方法檢測不同組織mRNA的表達分布方法如下：反轉錄按TaKaRa反轉錄試劑盒（TaKaRa RNA PCR Kit Ver.3.0）要求進行（同上述1.3）.RT-PCR時，赤眼鱒Myf5基因引物Zfmyf5F1/R1，兩條引物分別位于不同的外顯子上，以β-肌動蛋白基因（β-actin）為內標.PCR反應體系和條件：2.5μL 10×LA PCR Buffer（with Mg2+），2μL dNTP（2.5mmol/L each），上、下游引物各 1μL（10pmol/L），0.5μL cDNA，0.2μL LA Taq聚合酶（5U/μL）（Takara，大連），加滅菌ddH2O至25μL.PCR擴增條件：95℃變性5 min；95℃ 30s，58℃30s，72℃ 30s，25個循環（β-actin基因）或35個循環（myf5基因）；72℃延伸10min；4℃保存.

1.5 統計分析及軟件

將獲得的序列在DNAMAN 5.0軟件上進行分析，并進行物種間同源性比較.利用MEGA 4.1軟件中的Kimura 2-parameter法計算凈遺傳距離矩陣.以距離矩陣鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）建系統發生樹，通過自引導檢驗（bootstrap）獲得系統分支的置信度（重復次數為1000）.

2 結果與分析

2.1 赤眼鱒Myf5基因RT-PCR擴增鑒定

以赤眼鱒肌肉總RNA為模板，反轉錄后得到cDNA，用引物Zfmyf5F1/R1進行PCR擴增.通過1%的瓊脂糖凝膠電泳對擴增產物進行鑒定（見圖1）.大約350bp處有一條帶，與實驗預想結果接近.

2.2 赤眼鱒Myf5基因陽性篩選

將目的基因產物從膠塊中切下回收后連接到pMD-18T載體中，轉化DH5αE.CoLi感受態細胞后，在 LB（Ampr）平板上過夜培養.挑取白色單菌落于LB（Ampr）液體培養基中培養后做菌液PCR檢測（見圖2），將陽性克隆測序后獲得赤眼鱒的Myf5基因部分序列.

圖1 赤眼鱒Myf5基因片段的RT-PCR產物的1%瓊脂糖凝膠電泳圖

圖2 赤眼鱒Myf5基因陽性克隆篩選

2.3 赤眼鱒Myf5基因cDNA和氨基酸序列分析

對所得到的赤眼鱒Myf5部分序列進行分析，共編碼112個氨基酸（見圖3）.該段部分bHLH的堿性區及絞鏈區具有3個保守的氨基酸：丙氨酸Ala（A）、蘇氨酸Thr（T）和賴氨酸Lys（K），它們在蛋白質間的識別及構像形成上具有重要的作用.

利用MAGE 4.0軟件將赤眼鱒、斑馬魚、草魚、大馬哈魚、地中海鰨、紅點鮭、紅鰭東方鲀、三文魚和石斑魚9個物種的Myf5部分基因序列進行比對（見表2）.經過對比可發現，赤眼鱒的Myf5與紅點鮭同源性最低，與草魚同源性最高，為97.34%.

2.4 基于赤眼鱒Myf5部分cDNA序列的系統進化樹的構建

利用Mega 4.0軟件將赤眼鱒、斑馬魚、草魚、大馬哈魚、地中海鰨、紅點鮭、紅鰭東方鲀、三文魚和石斑魚9個物種Myf5部分基因序列構建系統進化樹（見圖4）.所構建的進化樹分為兩大支類.紅點鮭為單獨一支，另一支由斑馬魚、草魚、大馬哈魚、地中海鰨、赤眼鱒、紅鰭東方鲀、三文魚和石斑魚7種魚類組成，其中赤眼鱒與草魚的同源性最高.結果表明鯉科魚類Myf5基因的高度保守型，同時也顯示了鯉鮭科魚類Myf5基因的差異性.

2.5 赤眼鱒Myf5基因的組織表達分析

圖3 赤眼鱒Myf5基因部分序列及推測的氨基酸序列

圖4 鄰接法構建系統進化樹（數字表示bootstrap值）

采用半定量RT-PCR方法，檢測了Myf5基因mRNA在赤眼鱒肝、脾、肌、腎、心、鰓、腦、腸8種組織中的表達情況，同時以β-肌動蛋白基因的表達作為內參照.通過PCR條件優化，分別選擇β-actin基因和Myf5基因在擴增進入平臺期前的循環數為25次和35次.電泳結果顯示（見圖5），分別在 450bp、350bp獲得 Myf5和β-actin基因的部分特異性片段，與預期設計的試驗結果相符，發現在除脾臟外各種組織中都檢測到Myf5基因的表達，在心腎中表達量較高，肌肉和鰓中表達量次之，肝、腦和腸中表達量較弱.

表2 赤眼鱒與其他魚類Myf5部分基因編碼區的核苷酸同源性比較

圖5 赤眼鱒Myf5基因表達的半定量RT-PCR檢測

3 討 論

本研究首次克隆并測出赤眼鱒Myf5基因cDNA部分序列，共338bp，編碼112個氨基酸.將該序列與其他魚類的Myf5基因進行同源性比較.結果發現赤眼鱒與鯉科魚的同源性較高，其中與草魚的同源性最高，達到97.34%，與紅點鮭的同源性最低，只有33.14%，與其他魚類同源性在73.67%-84.32%.

Myf5是MRF基因家族的一員，該家族的共同結構特點是具有1個保守的中央蛋白基序（motif），其蛋白質二級結構都含有80個氨基酸左右，稱為堿性螺旋一環一螺旋（bHLH），bHLH高度保守，其中Basic結構是HLH螺旋結構的延伸，通過該結構域它們能夠與E蛋白形成二聚體，再與肌肉特異性基因如肌球蛋白輕鏈和肌酸激酶等基因的上游調控序列E-box結合，從而激活這些基因的表達［6,7］.HLH螺旋結構則是與其他因子相互作用的位點，即調控的重要區域.在MRF分子結構中，bHLH本身可形成僅α-螺旋二聚體和四聚體，但只有二聚體可與DNA結合，且二聚體的4個螺旋必須以平行方向排列，每個區域單獨存在均不能有效地激發生肌作用［8］.

本實驗對赤眼鱒Myf5基因mRNA進行組織表達的檢測.發現在除脾臟外各種組織中都檢測到Myf5基因的表達，在心臟和腎臟中表達量較高，肌肉和鰓中表達量次之，肝臟、腦和腸中表達量較弱.有報道，在海鱸（Lateolabrax japonicus）中Myf5主要在肌肉中表達，在腦、眼、脾、鰓、肝、腎、腸和心臟中也有表達.因此，Myf5基因的組織表達模式在不同的物種中不盡相同［9］.

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