陽離子脂質/DNA復合物氣霧劑的制備及其體外細胞轉染研究

盛芝娜，潘怡娜，魏曉慧，徐宇虹（上海交通大學藥學院，上海市200240）

基因治療（Gene therapy）和基因輸送（Gene delivery）是20世紀的新興研究領域，自1992年Stribling等[1]首次證明呼吸道基因給藥的可行性以來，已經被逐漸應用于多種呼吸道局部及全身性疾病的治療中，如肺部囊性纖維化、肺癌、哮喘等[2～4]。已報道[5]的基因呼吸道給藥方式主要有滴鼻給藥、氣道插管給藥、霧化吸入給藥等，但適用于耐壓定量氣霧（pMDI）裝置的基因給藥制劑還未見文獻報道。pMDI是吸入給藥裝置的一種，要求將藥物與適宜的拋射劑混合裝于具有特制閥門系統的耐壓容器中，使用時借助拋射劑的壓力將內容物呈霧狀噴出，患者配合呼吸主動吸入。pMDI氣霧劑的主要特點是在呼吸道分布廣泛且均勻，給藥劑量準確，同時攜帶、使用也很方便。

制備適用于pMDI裝置的基因給藥制劑所面臨的最大挑戰是：常用的基因載體都是水溶性，無法與拋射劑、助溶劑互溶灌裝成氣霧劑使用，因此研制出疏水性的基因載體是當務之急。本文根據Bligh and Dyer萃取原理[6]，改良后發展了一種新的陽離子脂質/DNA復合物的制備方法，對制得的載體系統進行了表征，并初步評價了灌裝后的氣霧劑的毒性及細胞轉染效率。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Laborota 4000旋轉蒸發儀（德國Heidolph公司）；Zetasizer Nano ZS90激光粒度分布儀（英國Malvern公司）；UV-21.2PC紫外分光光度計（美國Unico公司）；多功能酶標儀（美國Bio-Rad公司）；單管式化學發光分析儀（德國Berthold公司）；BCM-100生物潔凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司）；氣霧罐、定量閥及觸動器（蘇州萬通Aptar定量閥系統有限公司）；氣霧灌裝機（上海華新氣霧劑有限公司）。

1.2 試藥

陽離子脂質 DOTAP（1，2-dioleoyl-3-trimethyl-ammonium-propane，美國Sigma公司，批號：086K5200，純度：＞99%）；熒光素酶質粒pGL3-Control、熒光素酶檢測底物及細胞裂解液（美國Promega公司）；氟利昂F12（瑞麗氣體有限公司）；RPM I 1640培養基、胎牛血清（FBS）（美國Gibco公司）；MTT（北京博大泰克生物基因技術有限責任公司）；三氯甲烷、甲醇、異丙醇、無水乙醚、二甲亞砜等試劑均為分析純。

1.3 細胞模型

人肺腺癌細胞H1299（貼壁生長）由中國科學研究院上海細胞所提供。細胞在含10%胎牛血清的RPM I1640培養基中于37℃、5%CO2的細胞培養箱內連續培養。試驗細胞取處于對數生長期的細胞進行。

2 方法與結果

2.1 陽離子脂質/DNA復合物及其氣霧劑的制備

Bligh and Dyer萃取法[6]是將氯仿、甲醇、水以一定比例混合得到單相體系的過程，Reimer等[7]已應用該法制備得到疏水性的陽離子脂質/DNA的復合物。據此，筆者對該法進一步優化，發現當以氯仿-異丙醇-水替代氯仿-甲醇-水形成單相體系制備陽離子脂質/DNA復合物時，既可以獲得適宜大小的粒子，又可以顯著提高質粒DNA的包封率。

取0.5mg pGL3-Control溶解于水中，按氮-磷比（N/P ratio）＝1∶1、2∶1、4∶1、8∶1、16∶1分別取DOTAP適量溶于氯仿，將氯仿-異丙醇-水以體積比1∶2.6∶1混合。混合單相在室溫下充分反應30m in后，再加入等量的氯仿和水，于4℃、相對離心力2 700 g條件下離心7m in分層。分離下層相，旋蒸除去有機溶劑后再用2m L無水乙醚溶解；將該溶液轉移到氣霧瓶中，選用50μL的定量閥，用氣霧灌裝機封口后灌入一定量的拋射劑氟利昂（制劑溶液∶拋射劑＝1∶6，質量比）[8]制得氣霧劑。氣霧劑可以在室溫下保存，使用前倒置一夜以保證每噴定量。

2.2 DOTAP/DNA復合物的表征

用定磷法[9]測定制備的有機相中DNA的含量，按公式：載藥率＝有機相中DNA含量/投藥量×100%，計算DOTAP/DNA復合物裝載DNA的效率。用激光粒度分布儀測定制備所得的DOTAP/DNA復合物在乙醚溶劑中的粒徑，以及氣霧劑噴出后在水相中收集到的復合物的粒徑。所有數據為連續制備的3批制劑的參數測定平均值，詳見表1。

表1 不同N/P比的DOTAP/DNA復合物的表征參數（ ±s，n＝3）Tab 1 Characterization parameters of DOTAP/DNA comp lexesw ith different N/P ratios（ ±s，n＝3）

表1 不同N/P比的DOTAP/DNA復合物的表征參數（ ±s，n＝3）Tab 1 Characterization parameters of DOTAP/DNA comp lexesw ith different N/P ratios（ ±s，n＝3）

表征參數氣霧劑水相收集液中平均粒徑/nm 639.400±85.657 245.200±58.830 397.500±139.400 714.900±56.510 1 966±708 N/P比1∶1 2∶1 4∶1 8∶1 16∶1 DOTAP/mg 1.040 2.080 4.160 8.320 16.640載藥率/%37.400±0.900 72±1.580 67.400±1.720 57.100±1.321 45±1.208乙醚溶劑中平均粒徑/nm 484.800±91.060 188.700±42.770 263.400±59.610 563.100±128.230 1 673±356.112

由表1可見，當陽離子脂質DOTAP和DNA以N/P比2∶1和4∶1混合制備時，得到的DOTAP/DNA復合物及其氣霧劑具有較高的載藥率，且粒徑分布較穩定均一。

2.3 氣霧劑的細胞毒性試驗

由于氣霧劑中所含的乙醚等溶劑本身具有一定的細胞毒性，所以通過預試驗考察權衡了溶劑毒性與轉染效率的關系，最終選擇了毒性較低且能保證轉染效率檢測的每孔4μg DNA（6孔板）的投藥量，來評價氣霧劑的細胞毒性大小。用經典的MTT法測定：將不含DOTAP/DNA復合物，即僅罐裝等量無水乙醚的空白氣霧劑作為陰性對照組，N/P比為2∶1、4∶1的氣霧劑為試驗組；H1299以2×104個/m L的細胞濃度、每孔2m L加入6孔板中，置于37℃、5%CO2飽和濕度下培養24 h，移除培養基，每孔噴入氣霧劑各6噴（每噴含有0.667μg DNA量），每個濃度設3個平行復孔；孵育4 h后，置換為1.5m L新鮮的完全培養基，24 h后，每孔加入5mg·m L－1的MTT 150 μL，繼續培養4 h后，再加入二甲亞砜1.5m L，溶解沉淀。用酶聯免疫檢測儀在490、650 nm波長條件下分別測定每孔的光密度（OD），其中490 nm為檢測波長，650 nm為參比波長。以滴加磷酸鹽緩沖溶液（PBS）的細胞作為空白對照（100%），按以下公式計算各組細胞的相對存活率：細胞相對存活率＝（試驗組OD490nm－試驗組OD650nm）/（空白對照組OD490nm－空白對照組OD650nm）×100%，結果如圖1所示。

圖1 各組細胞相對存活率結果（n＝3）Fig 1 Relative cellsurvival rate of each group（n＝3）

由圖1可知，陰性對照組即空白氣霧劑的毒性主要是由氣霧噴力及有機試劑導致的，但基本可以保證細胞（95.600±7.300）%的存活率；N/P比為2∶1和4∶1時DOTAP/DNA復合物氣霧劑分別可以維持（91.643±6.970）%和（87.630±7.643）%的存活率。其細胞毒性相對于陰性對照來說差異并不顯著，可見制劑本身導致的毒性比較小。

2.4 DOTAP/DNA氣霧劑的細胞轉染效率研究

H1299細胞以2×104個/m L的密度、每孔2m L傳入6孔板上，培養24 h。將裸DNA（pGL3-Control）溶液直接滴加至細胞板孔內作為對照組，N/P比2∶1、4∶1的氣霧劑為試驗組，以每孔6噴的劑量噴入。孵育4 h后置換新鮮培養基，同條件下繼續培養24 h后，檢測熒光素酶活性，以每1mg細胞蛋白的相對光單位（RLU·mg－1）來表示轉染效率的強度。RLU·mg－1值越高，轉染效率則越高，試驗結果見圖2。

圖2 各組熒光強度結果與其他2組比較：＊P＜0.05Fig 2 Resultsof fluorescence intensity in each group vs.other2 groups：＊P＜0.05

圖2 結果表明，相比于裸DNA組和N/P比為4∶1的氣霧劑組，N/P比為2∶1的氣霧劑組的熒光強度最高，即其轉基因表達效率最高，具有較好的基因轉染活性（P＜0.05）。

3 討論

呼吸道基因輸送系統在近20年得到不斷的發展并具有廣闊的應用前景。吸入給藥是呼吸道給藥的主要方式之一，其相比滴鼻給藥能夠更有效地分布至下呼吸道，同時又可以避免氣道插管法的強侵入性[10，11]。目前吸入制劑有氣霧劑、霧化劑、噴霧劑和粉霧劑4種，氣霧劑具有易攜帶、易使用、呼吸道分布廣泛均勻等特點，但是在呼吸道基因輸送方面還沒得到應有的應用和重視，這主要與基因載體水溶性的物化性質有關。本研究采用溫和的制備方法——改良的Bligh and Dyer萃取法，制得可以分散于有機溶劑的DOTAP/DNA復合物，并與氟利昂灌裝得pMDI氣霧劑，為pMDI應用到呼吸道基因輸送系統的研究增添了新的方向和技術。

本文制備了一系列不同N/P比的DOTAP/DNA復合物，測定發現最高的DNA裝載效率約為（72±1.580）%，其粒徑大小為（188.700±42.770）nm；又進一步在細胞試驗中考察了幾種不同N/P比的氣霧劑的毒性和基因轉染效率。結果表明，N/P比為2∶1的氣霧劑能夠有效地介導DNA對肺癌細胞的基因轉染。這為該氣霧劑下一步的體內研究提供了依據，可在呼吸道局部及全身性疾病的基因治療方面進行嘗試，如肺部囊性纖維化、肺癌、哮喘及疫苗等。

綜上所述，本試驗采用改良的Bligh and Dyer萃取法，制得了大小均一、DNA裝載效率較高的DOTAP/DNA復合物及氣霧劑。體外研究試驗表明，其細胞相對存活率分別維持在（91.643±6.970）%和（87.630±7.643）%，細胞毒性較低，同時可以顯著提高細胞蛋白轉染效率，預示著該pMDI氣霧劑作為呼吸道基因輸送系統的潛力和可行性。

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