不同程度乳腺炎血清中相關細胞因子的試驗

李曉蕾，張 宇，劉本軍，高 利

（東北農業大學動物醫學學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

奶牛乳腺炎作為危害養牛業的一大疾病，臨床診斷和防治一直是研究的重點，特別是臨床診斷方面的研究一直是研究的熱點。有關IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α等因子與炎癥的關系目前比較明朗，但他們的變化及變化趨勢與不同程度乳腺炎的發展趨勢是否存在相關性還不確定，基于此，本試驗通過體細胞分類確定不同程度乳腺炎，同時測定這些病例血清中IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α的變化，探討奶牛乳腺炎的發病程度及變化是否與上述4種細胞因子含量及變化存在一定關系，為今后診斷奶牛乳腺炎提供一種參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 IL-1β放免試劑盒，IL-6放免試劑盒，IL-8放免試劑盒，TNF-α放免試劑盒，體細胞計數儀，電冰箱，高速離心機，全自動γ免疫計數器。

1.2 試驗動物及分組 阿城區某奶牛場，本試驗選取年齡在4～8歲，2～5胎的經產奶牛，要求奶牛處于泌乳盛期或中期，即產后2～7個月。通過現場臨床檢查和CMT的檢測及體細胞計數儀的檢測進行分組。其中10頭檢測為陰性的奶牛編為C組，乳汁體細胞檢查在0～50萬個／mL；10頭檢測為輕度隱性乳腺炎奶牛編為Ⅰ組，乳汁體細胞檢查在50萬～150萬個／mL；10頭檢測為重度隱性乳腺炎奶牛編為Ⅱ組，乳汁體細胞檢查在150萬～500萬個／mL；10頭檢測為臨床型乳腺炎的奶牛編為 Ⅲ 組，乳汁體細胞檢查在500萬個／mL以上。

1.3 方法

1.3.1 血樣采集、血清制備 頸靜脈采集血樣C組、Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組各10頭奶牛的血液，采樣前消毒取血部位，對每頭牛約取15mL的血液。自然凝固1～2h，冰浴30min，然后3000r／min離心10 min，分離血清，4℃保存，待測。

1.3.2 結果判斷 放射免疫分析法。結果計算：以N／T、B／T計算NSB、S0結合百分率，以B／B0計算標準及待測物結合百分率，在半對數座標紙上繪制標準曲線，并查出樣品值或由自動γ-計數儀器直接讀結果。

1.3.3 數據處理 SPSS數據分析。

2 結果與分析

血清中IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α含量的測定見表1。

表1 血清各組中IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α含量SD）

表1 血清各組中IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α含量SD）

＊：顯著性差異，P＜0.05；＊＊：極顯著性差異，P＜0.01

由表1和圖1～4可以看出：（1）與C組比較，Ⅰ組IL-1β的含量無顯著變化（P＞0.05），Ⅱ組、Ⅲ組IL-1β的含量極顯著升高（P＜0.01）。（2）與C組比較，Ⅰ組IL-6的含量無顯著變化（P＞0.05），Ⅱ組、Ⅲ組IL-6的含量極顯著升高（P＜0.01）。（3）與C組比較，Ⅰ組IL-8的含量顯著升高（P＜0.05），Ⅱ組、Ⅲ組IL-8的含量極顯著升高（P＜0.01）。（4）與C組比較，Ⅰ組TNF-α的含量顯著升高（P＜0.05），Ⅱ組、Ⅲ組 TNF-α的含量均極顯著升高（P＜0.01）。由此可知，奶牛乳腺發生炎癥后血清中IL-6、IL-8、TNF-α含量均高于正常奶牛，且含量隨炎癥程度的加劇逐漸升高；而血清中IL-1β的含量也隨炎癥程度的加劇逐漸升高，但到臨床癥狀明顯時含量又有所下降。

3 討論

IL-1β是炎癥反應早期最具影響的介質之一。當奶牛發生乳腺炎癥狀后，IL-1β的產生和釋放逐漸增加，當出現明顯的臨床癥狀時含量有所減少，但仍然高于對照組。主要原因可能是因為IL-1β是急性期反應的主要誘導物，待炎癥發生后在體內的含量也逐漸降低。

IL-6是炎癥細胞因子網絡中的重要組成成分，與體內感染性疾病的發生和發展密切相關（Headley A S，et al.，1997）。有研究表明，奶牛乳腺炎的發生和臨床癥狀與細胞因子有關，乳腺炎急性期反應就是由IL-6和TNF-α等細胞因子激發和介導（Taylor B C，et al.，1997；Zhu Y，et al.，2007）。IL-6是一種遲發性細胞因子，能催化和放大炎性反應，隨著炎癥的加劇體內IL-6含量也增加，與此同時，炎癥激活機體免疫功能，血液中的淋巴細胞被活化后IL-6等炎性反應因子分泌合成功能增強，于是血液中IL-6含量也增加（吳朝棟，1995）。

IL-8是PMN、嗜堿性粒細胞以及T細胞等細胞的趨化因子，在炎癥反應中具有重要作用（Matsushima K，1994）。本試驗表明，IL-8隨炎癥的加劇含量也逐漸增加，這主要是因為當乳腺發生炎癥時，血清中內毒素水平增高而刺激炎性細胞釋放IL-1、TNF-α等細胞因子，在這些細胞因子的刺激誘導下，單核細胞和PMN等多種細胞均可產生IL-8，這一結果表明，血清中的IL-8有助于機體炎癥的發展。TNF-α參與炎癥反應并且加劇炎癥的發生。本試驗表明，TNF-α可大量分泌，與之前（Spicer L J 2001）報道的當奶牛發生乳腺炎時，IL-6、TNF-α的釋放增加，其含量與臨床癥狀的嚴重程度呈正相關的報道一致。TNF-α可能是導致乳腺炎病情加重的原因。血清中TNF-α水平可作為今后檢測乳腺炎病程嚴重程度的一項重要指標。

以上試驗結果表明，這4種細胞因子除IL-1β以外，其他細胞因子在血清中的含量均隨著炎癥的加劇逐漸增加。而血清中IL-1β的含量也隨著炎癥的加劇逐漸增加，當出現明顯的乳腺炎癥狀時，含量又有所減少，但仍然顯著高于對照組。由此可知，奶牛血清中的IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α的含量與奶牛乳腺是否發生炎癥反應以及奶牛機體的免疫狀態密切相關（Dernfalk J，et al.，2007）。

4 結語

奶牛乳腺發生炎癥后血清中IL-6、IL-8、TNF-α含量與正常奶牛比較隨炎癥程度的加劇逐漸升高；但IL-1β的含量隨炎癥程度的加劇表現先升高后降低。表明，奶牛血清中IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α的含量與奶牛乳腺炎的發病程度密切相關。

［1］吳朝棟.內毒素誘生的細胞因子及其作用研究進展［J］.國外醫學免疫學分冊，1995，3（1）：11-14.

［2］Dernfalk J，Persson Waller K.The xMAP technique can be used for detection of the inflammatory cytokines IL-1beta，IL-6and TNF-alpha in bovine samples［J］.Vet Immunol Immunopathol，2007，118（1-2）：40-49.

［3］Headley A S，Tolly E，Meduri G E，et al.Infection and the inflammatory respond in acute respiratory distress syndromc［J］.Chest，1997，111：1306-1312.

［4］Matsushima K.Properties of interleukin-8and its correlation with inflammatory diseases and malignant neoplasia［J］.Gan To Kagaku Ryoho，1994，21：2525-2532.

［5］Spicer L J.Receptors for insulin-like growth factor-I and tumor necrosis factor-alpha are hormonally regulated in bovine granulosa and thecal cells［J］.Anim Reprod Sci，2001，67：45-58.

［6］Taylor B C，Keefe R G，Dellinger J D，et al.T cell Population and cytokine expression in milk derived from normal and bacteria-infected bovine mammary glands.Cellular Immunology［J］.1997，182（2）：68-76.

［7］Zhu Y，Fossum C，Berg M，et al.Morphometric analysis of proinflammatory cytokines in mammary glands of sows suggests an association between clinical mastitis and local production of IL-1beta，IL-6and TNF-alpha［J］.Vet Res，2007，38（6）：871-882.