不同程度奶牛乳腺炎IL-1βIL-6的試驗

劉本君，張久麗，高 利，王洪偉，魏成威

（1.黑龍江科技職業學院動物醫學學院，黑龍江 雙城 150111；2.東北農業大學動物醫學學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

奶牛乳腺炎是指奶牛的乳腺組織內發生的不同程度的炎癥，并伴有乳汁物理、化學及微生物學變化。它一般是由病原微生物感染、飼養管理、環境、遺傳等因素綜合作用引起的。乳腺炎的發生不僅使發情配種的時間延長，降低了奶牛的生產性能，而且還嚴重地影響了牛奶制品的品質，危及人類健康。

細胞因子是機體免疫系統的重要組成部分，具有調節多種細胞的生理功能。它們是細胞間相互溝通的橋梁之一，通常以網絡的形式存在，并且相互影響，相互誘生，在機體炎癥反應和免疫應答的過程中具有十分重要的作用。白細胞介素1（interleukin-1，IL-1）是由Grey等人于1972年發現的一種能激活多種免疫細胞和炎癥細胞的前炎性細胞因子。IL-1主要由單核-巨噬細胞和嗜中性粒細胞等產生的。根據其分子的結構和等電點不同，IL-1分為IL-1α和IL-1β，IL-1β具有廣泛的生物活性，是體內作用最強的炎癥介質之一。研究表明，IL-1β能夠促進血管內皮-白細胞黏附分子的表達，趨化嗜中性粒細胞等炎性細胞進入機體病變部位，從而引起一系列炎癥反應，其細胞因子mRNA的表達與炎癥程度呈正相關，可作為臨床上判斷疾病嚴重程度和療效的指標［1］。白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）是一種多功能的細胞因子，是由激活的巨噬細胞、淋巴細胞及上皮細胞等產生和分泌的一種糖蛋白。體內的多種細胞既能產生和釋放IL-6，受到刺激后也能表達IL-6基因，因此說IL-6在免疫和炎癥反應中發揮重要作用。IL-6能促進嗜中性粒細胞的活化和聚集，血清中IL-6水平可反應組織損傷程度［2］。IL-6表達失調與一些疾病的發生密切相關，在自身免疫性疾病、多發性骨髓瘤、骨質疏松癥的病人中都出現IL-6的失控性表達［3］。

1 材料與方法

1.1 試驗動物分組 利用乳汁體細胞計數儀檢測法對阿城區某奶牛示范基地的40頭試驗奶牛進行分組，要求全部奶牛年齡和泌乳期相近，分為C組（SCC＜50萬個／mL）、Ⅰ組（50萬個／mL＜SCC＜150萬個／mL）、Ⅱ組（150萬個／mL＜SCC＜500萬個／mL）、Ⅲ組（SCC＞500萬個／mL）。

1.2 樣品采集

1.2.1 血樣的采集 頸靜脈采集C組、Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組各10頭奶牛的血液，采樣前消毒取血部位，對每頭牛約取15mL的血液，將采集的血樣室溫下靜止。

1.2.2 乳樣的采集 采集C組、Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組各10頭奶牛的乳汁，采樣前對乳區進行清洗，然后用70%酒精消毒乳區，棄掉頭2把乳汁，進行全天采樣，從早上6點開始，每間隔5h進行取樣，取樣3次，每次20mL，最后混入無菌奶瓶中。將采集的乳樣放到有冰塊的泡沫箱中，將乳樣帶回東北農業大學病理實驗室檢測。

1.3 樣品處理與測定

1.3.1 血樣的處理及測定 頸靜脈采集血液，在室溫下，一般要求不超過20℃，自然凝固1～2h，冰浴30min，然后3000r／min離心10min，分離血清，4℃保存，待測。如檢測時間較長，要將樣品置于-80℃冰箱中保存備用。樣品采用北京華英生物技術研究所IL-1β、IL-6放免試劑盒進行測定。

1.3.2 乳樣的處理及測定 將乳樣3000r／min離心5min，除去上層乳脂，然后于16000r／min高速離心機中離心10min，去除沉淀，保留上清，4℃保存，待測。如檢測時間較長，要將樣品置于-80℃冰箱中保存備用。樣品采用北京華英生物技術研究所IL-1β、IL-6放免試劑盒進行測定。

1.4 數據分析 利用軟件SPSS 13.0統計分析進行分析處理，數據用SD表示。

2 結果

表1 血清各組中IL-1β、IL-6含量

圖1 血清各組中IL-1β含量

圖2 血清各組中IL-6含量

表2 乳清各組中IL-1β、IL-6含量

圖3 乳清各組中IL-1β含量

圖4 乳清各組中IL-6含量

3 討論

奶牛的乳腺是機體內一個復雜生物反應器，在乳腺內部，眾多的保護因子包括細胞因子、抗體、激素、酶和神經遞質等一起構建了多條錯綜復雜的信號通路，這些因子之間的動態平衡是維持乳腺健康的基本條件。當奶牛乳腺發生炎癥時，機體抵抗力下降，體內細胞因子及其受體的表達就會發生異常［4］。因此，重視對細胞因子及其受體的檢測，對研究細胞因子在乳腺炎癥反應中的平衡十分必要。

IL-1β作為炎癥和免疫源性的細胞因子，參與體內多種炎癥反應。在正常情況下，血液中IL-1β的含量很低，但是在理化和生物等因素的誘導下，單核-巨噬細胞、淋巴細胞等均能表達及釋放IL-1β，并在體內發揮多種生物學效應。本試驗結果顯示，血清和乳清中IL-1β的含量與C組比較，Ⅰ組IL-1β的含量無顯著變化（P＞0.05），Ⅱ組、Ⅲ組IL-1β的含量極顯著升高（P＜0.01），這與 Wenz等報道的IL-1β隨奶牛乳腺炎程度的增加而增加相一致［5］。IL-1β是炎癥反應早期最具影響的介質之一［6］，因此能較早而敏感的反映出組織損傷的程度。當奶牛發生乳腺炎癥后，主要表現為炎區周圍嗜中性粒細胞的浸潤并釋放細胞因子，同時微循環出現損傷。隨著炎癥的加劇，IL-1β的產生和釋放也逐漸增加，當出現明顯的臨床癥狀時含量有所減少，但仍然高于對照組。主要原因可能是因為IL-1β是急性期反應的主要誘導物，待炎癥發生后在體內的含量也逐漸降低。另外，到了炎癥后期TNF-α的大量分泌對IL-1β分泌也起到一定的抑制作用。

IL-6是炎癥細胞因子網絡中的重要組成成分，與體內感染性疾病的發生和發展密切相關。有研究表明，奶牛乳腺炎的發生和臨床癥狀與細胞因子有關，乳腺炎急性期反應就是由IL-6和TNF-α等細胞因子激發和介導。本試驗結果顯示，血清中IL-6的含量與C組比較，Ⅰ組IL-6的含量無顯著變化（P＞0.05），Ⅱ組、Ⅲ組IL-6的含量極顯著升高（P＜0.01）；乳清中IL-6的含量與C組比較，Ⅰ組IL-6的含量顯著升高（P＜0.01或P＜0.05），Ⅱ組、Ⅲ組IL-6的含量極顯著升高（P＜0.01）。IL-6是一種遲發性細胞因子，能催化和放大炎性反應，隨著炎癥的加劇體內IL-6含量也增加，主要是奶牛乳腺發生炎癥后，炎癥刺激乳房局部的巨噬細胞和上皮細胞，使乳汁中IL-6含量增加。與此同時，炎癥激活機體免疫功能，血液中的淋巴細胞被活化后IL-6等炎性反應因子分泌合成功能增強，于是血液中IL-6含量也增加。另外體內IL-1和TNF-α的增加也可促進IL-6的產生［7］。Hagiwara K 等［8］研究表明，患急性乳腺炎奶牛乳清與血清中IL-6的含量高低，與乳腺炎發病程度及恢復情況有著線性關系，可以成為治療乳腺炎效果的指標。

不同程度乳腺炎乳汁中IL-6的活性隨著乳腺炎的嚴重程度的增加而呈遞增趨勢，均高于C組，但Ⅰ組血清中的IL-6含量與對照組無顯著變化，不具備乳腺炎的評價。不同程度乳腺炎血液中和乳汁中IL-1β的活性均隨著乳腺炎的嚴重程度的增加而呈遞增趨勢，表現為先升高后降低，不具備評價乳腺炎的價值。由此可知，奶牛血清和乳清中的IL-1β、IL-6的含量與奶牛乳腺是否發生炎癥反應以及奶牛機體的免疫狀態密切相關，并且乳汁中的IL-6可作為奶牛乳腺炎診斷指標。

［1］Christman J W，Sadikot R T，Blackwell T S.The Role of Nuclear Factor-Kappa B in Pulmonary Diseases［J］.Chest，2000，117（5）：1482-1487.

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［4］Riollet C，Rainard P，Poutrela B.Cell subpopulations and cytokine expression in cow milk in response to chronic Staphylococcus aureus infection［J］.J Dairy Sci，2001，84（5）：1077-1084.

［5］Wenz J R，Fox L K，Muller F J，et al.Factors associated with concentrations of select cytokine and acute phase proteins in dairy cows with naturally occurring clinical mastitis［J］.J Dairy Sci，2010，93：2458-2470.

［6］Rezamand P，McGuire M A.Effects of trans fatty acids on markers of inflammation in bovine mammary epithelial cells［J］.J Dairy Sci，2011，94：316-320.

［7］吳朝棟.內毒素誘生的細胞因子及其作用研究進展［J］.國外醫學：免疫學分冊，1995，3（1）：11-14.

［8］Hagiwara K，Yamanaka H，Hisaeda K，et al.Concentration of IL-6in serum and whey from healthy and mastitic cows［J］.Vet Res Commun，2001，25（2）：99-108.