黃芩多糖體外抗新城疫病毒活性試驗

王鑫瀅，張秀英

（東北農業大學動物醫學學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

現代藥理研究表明，黃芩（Scuxiutellaria baicalensis Georgi）的粗提物及其活性部位、單體具有多種藥理活性［1-2］，但對新城疫病毒（NDV）的作用目前未見報道。NDV可引發雞和火雞的急性、熱性、敗血性疫病，具有高度的接觸傳染性，嚴重危害世界養雞業的發展［3-4］，目前獸醫臨床缺乏有效的防治藥物。因此，研究開發出耐藥性低、副作用和不良反應少的有效藥物對新城疫的預防及治療都具有重大的現實意義。本文通過對黃芩多糖的體外抗NDV的作用進行試驗，為抗NDV的新型藥物的研發打下基礎。

1 材料與方法

1.1 雞胚 新城疫病毒F48E9強毒株由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所提供；HA為1∶26。

1.2 藥品與試劑 黃芩（黑龍江中醫藥大學），胰酶，優級胎牛血清，DMEM，四甲基氮唑鹽（MTT），二甲基亞砜（DMSO），均來自Sigma公司。

1.3 主要儀器和設備 CO2培養箱（Thermo，德國），倒置顯微鏡（Nikon，日本），恒溫水浴鍋（上海一恒科技有限公司），索氏提取器。

1.4 雞成纖維細胞制備［3］取10日齡雞胚，經取材、清洗、剪碎、再清洗、消化、吹打、過濾，在37℃CO2培養箱中培養24h，制成雞成纖維細胞。

1.5 黃芩多糖的提取、分離、純化［4］利用水提醇沉法提取黃芩多糖，Sevage法（氯仿∶正丁醇=5∶1），除去蛋白，透析除去無機物和大分子物質，真空干燥，即得黃芩多糖。

1.6 黃芩多糖對細胞安全濃度（TC0）的測定 在CEF中分別加入不同濃度的黃芩多糖，37℃CO2培養箱中繼續培養，觀察細胞病變情況，根據細胞病變程度（CPE）再結合 MTT法確定多糖對細胞的TC0。CPE的記錄方法：“-”為沒有細胞出現CPE；“+”為1%～25%的細胞出現CPE；“++”為26%～50%的細胞出現CPE；“+++”為51%～75%的細胞出現CPE，“++++”為76%～100%的細胞出現CPE。

1.7 黃芩多糖抗NDV的活性試驗 在黃芩多糖安全濃度的基礎上，將其進行倍比稀釋，濃度分別為1∶2～1∶64，0.22μm濾菌膜過濾除菌后，進行以下操作：（1）先加多糖后接種病毒：將各濃度的多糖加入到CEF中，繼續培養24h后取出，加入用維持液稀釋成100TCID50的病毒液，100μL／孔。（2）先接種病毒后加多糖：將100TCID50的病毒液，100 μL／孔，加入到CEF中，繼續培養2h后取出，然后加入各種濃度的多糖。（3）病毒和多糖同時加入：先將100TCID50的病毒液，100μL／孔，加入到 CEF中，緊接著加入各種濃度的多糖。

以上3組試驗，加入各個濃度多糖和病毒液（多糖+病毒組）的為試驗組；只加多糖不加病毒液的為多糖對照組；同時設病毒唑陽性藥物對照組，加病毒唑（用維持液稀釋終濃度為4000μg／mL，由預試驗而定）；病毒對照組，加病毒液；細胞對照組，加維持液。100μL／孔，每種濃度重復4孔，另設一無細胞孔僅加維持液作為測定時調零孔，繼續培養，每組以加入病毒液后計算時間，每隔12h觀察一次CPE變化，直至病毒對照組出現典型的CPE（++++）病變后為記錄終點，MTT法檢測細胞OD值。

多糖抗病毒活性的評價標準：根據OD值統計，比較多糖+病毒組、病毒唑對照組與病毒對照組；多糖組與細胞對照組；多糖+病毒組與同濃度多糖組之間的OD值，判定多糖的抗病毒活性強弱。在多糖對細胞增殖無顯著影響或顯著抑制細胞增殖前提下，若多糖+病毒組OD值顯著大于病毒對照組，且與同濃度中藥組差異不顯著，判為多糖具有顯著的抗病毒活性；若多糖+病毒組顯著大于病毒對照組且顯著小于同濃度多糖組，或與病毒對照組及同濃度中藥組差異均不顯著，判為多糖具有一定抗病毒活性；若多糖+病毒組與病毒對照差異不顯著，且顯著小于同濃度多糖組，判為多糖無抗病毒活性［6］。計算藥物的治療指數（TI）=最大無毒濃度／最小有效濃度。TI值越高，多糖的安全性越高。

2 結果與討論

2.1 黃芩多糖對細胞最大安全濃度的測定 見表1。

表1 加入各濃度黃芩多糖后各組細胞的細胞存活率

由表1的OD值變化可知，隨著多糖濃度逐漸降低，細胞存活率逐漸升高，濃度在125.00μg／mL時細胞存活率達到97%，可初步認為對CEF的生長基本無影響，綜合CPE和MTT結果可確定黃芩多糖對細胞的最大安全濃度為TC0=125.00μg／mL。

2.2 黃芩多糖抗病毒活性檢測結果 見表2、3、4。

表2 先加藥物后加病毒組的OD值變化

根據多糖抗病毒活性的評價標準：通過統計學方法分析可知多糖濃度為125μg／mL和62.5μg／mL時，具有顯著的抗病毒活性；多糖濃度為31.25μg／mL及15.63μg／mL時，可以判定其具有一定的抗病毒活性；多糖濃度為7.81μg／mL時，可以判定為無抗病毒活性。黃芩多糖的TI=125／15.63=8。

表3 先加病毒后加藥物組的OD值變化

根據多糖抗病毒活性的評價標準：統計學分析可知多糖濃度為125μg／mL和62.5μg／mL時，可以判定具有一定的抗病毒活性；其余各濃度的多糖，可以判定為無抗病毒活性。黃芩多糖的TI=125／62.5=2，這表明黃芩多糖直接殺滅NDV的作用較弱。

表4 藥物與病毒同時加入組的OD值變化

3 討論

通過NDV對雞胚成纖維細胞的強力致病變作用特性，在此基礎上對黃芩多糖抗NDV的活性進行了系統的試驗。結果表明，黃芩多糖對NDV具有較好的預防及治療作用，兩種作用的治療指數均達到8，同時表明黃芩多糖的藥物安全性很高；但是黃芩多糖對病毒的直接滅活作用相對較低，治療指數僅為2，可能是由于多糖對細胞的吸附能力較病毒弱，發揮實效較短。綜合試驗結果可知，如果進一步加深對黃芩多糖的研究與開發，有望研發出安全性高，毒副作用小，效果可靠的新型抗新城疫藥物。

［1］賀海平.黃芩藥理研究的新進展［J］.國外醫學：中醫中藥分冊，2000，22（1）：14-16.

［2］劉樺，吳曉冬，閆倩，等.黃苓苷對缺氧缺糖性心肌細胞的保護作用［J］.中國藥科大學學報，2003，34（1）：55-57.

［3］殷震，劉景華.動物病毒學［M］.2版.北京：科學出版社，1997.

［4］劉云.當歸多糖的提取及含量測定［J］.現代中藥研究與實踐，2003，17（1）：49-50.

［5］司徒正強，吳軍正.細胞培養［M］.西安：世界圖書館出版公司，2004.

［6］胡元亮，孔祥鋒，李祥瑞，等.10種中藥成分對CEF的增值和抵抗 NDV感染的影響［J］.畜牧獸醫學報，2004，35（3）：301-305.