蛹蟲草繼代培養后主要生物學性狀的變化*

王 熙，張 佳，張國珍

（中國農業大學植物病理學系，農業部植物病理學重點實驗室，北京 100193）

蛹蟲草（Cordyceps militaris）又稱北冬蟲夏草、北蟲草等，是一種蟲生藥用真菌，為我國名貴的中藥材之一，具有很高的藥用價值和營養價值。蛹蟲草在自然界有著廣泛的分布，但自然資源匱乏，遠不能滿足人們的需求[1]。因此，如何高產優質地人工培養蛹蟲草顯得尤為重要。目前，蛹蟲草的栽培方式主要是在固體培養基上接種或在昆蟲活蛹上接種蛹蟲草，在一定溫度、濕度和光照條件下培養后收獲子實體[2-4]。子實體是蛹蟲草的藥用部位，也是有性生殖的產物。已有研究表明蛹蟲草為異宗配合真菌[5]，即需要2個相反交配型（MAT-1、MAT-2）的菌株才能完成有性生殖，產生子實體。子實體的產生除了與交配型基因有關外，還與栽培過程中的外界環境條件有關。為了促進子實體的形成，提高蛹蟲草的產量，可以從選種、培養料配制以及栽培條件和技術等的改進來提高產量[6-8]。與其他絲狀真菌相似，蛹蟲草在培養過程中其生物學性狀會發生一些變化，如菌種 “退化”[3]、發生菌落角突變和子實體產量下降[9]等。本研究組對蛹蟲草有性孢子的萌發過程和有性后代群體的培養性狀進行了觀察[10]。但是，對于蛹蟲草菌株尤其是來自有性后代子囊孢子的菌株，在繼代培養過程中其生物學性狀的變化缺乏系統觀察和研究。本試驗的目的是研究蛹蟲草不同菌株經多次繼代培養后，在菌落性狀、生長速率、產孢量以及子實體形成等生物學性狀方面會發生哪些變化，以便為深入研究菌株退化問題提供一定的線索。

1 材料和方法

1.1 供試菌株

根據菌株來源、菌落特征等，本試驗選取了4個單子囊孢子菌株和1個組織分離的菌株，其中2個單子囊孢子菌株分離自野生蛹蟲草子實體，2個單子囊孢子菌株分離自人工培養的子實體，5株代表菌株的信息見表1。

表1 供試菌株的交配型、菌落性狀及其來源

4個單子囊孢子菌株單獨培養時均不能形成子實體，組織分離的菌株可以形成子實體。單子囊孢子菌株的分離參照梁月等[10]的方法。交配型的確定采用分子生物學方法（專利號： 200910085789.4）。

1.2 培養基及培養條件

單子囊孢子的分離使用2.0%水瓊脂培養基，菌株的培養使用改良的PDA培養基，改良PDB液體培養基用于子實體形成試驗中接種體的制備，子實體形成試驗所用培養基為大米培養基，參照梁月等[10]的方法進行。

1.3 菌絲生長速率測定及菌落形態的觀察

將供試菌株在改良PDA培養基上于21℃、光照條件下培養，至菌落將要長滿6 cm培養皿時，用直徑5 mm的打孔器在菌落邊緣打取菌餅，定量接種至新的改良PDA培養基上，同樣條件下培養15 d，記為第1代菌株，用同樣的方法進行繼代培養，每培養15 d為1代。在培養過程中，每天測量菌落直徑，取15 d的平均值為當代的平均菌絲生長速率。同時，觀察菌落的顏色與質地。每個菌株每代重復3皿。

分離自野生子實體的2個菌株已培養至第18代，來自于人工栽培子實體的3個菌株已培養至第11代。

1.4 產孢量的測定

將菌株按方法1.3培養15 d，在菌落半徑1/2處用8 mm打孔器打取3個菌餅，放入10 mL 0.45‰吐溫水溶液中，用振蕩器震蕩1 min后制成分生孢子懸浮液，稀釋后用血球計數板計數分生孢子的濃度，最終換算成單位菌落面積的孢子數（個·cm-2）。每隔5代測定1次菌株的產孢量。每個菌株重復3皿。

1.5 子實體形成能力的測定

用PDB液體培養基洗下平板培養基上培養的孢子和菌絲，取1 mL接種到含有40 mLPDB培養基的三角瓶中，搖床培養3 d～4 d后，接種到大米培養基上培養。45 d后觀察子實體的產生情況并稱重。每隔5代進行1次子實體產生試驗，每個菌株重復4次。

2 結果與分析

2.1 繼代培養過程中菌絲生長速率的變化

繼代培養過程中菌絲生長速率的變化情況見圖1。

圖1 蛹蟲草不同菌株繼代培養過程中生長速率變化

5個菌株的菌絲生長速率有一定差異，來自于野生子實體的2個菌株09-40-4和09-40-5，在第7代之前生長速率有一定波動，之后有比較明顯的下降，第18代的生長速率與第1代相比分別下降了19%和27%；來自于人工栽培子實體的2個菌株5E-10-2和5E-10-7，在第2代之后生長速率就有明顯的下降，第11代的生長速率與第1代相比分別下降了21%和19%，而組織分離的菌株5E-10-Z2生長速率在第5代之后開始下降，第11代的生長速率比第1代下降了6.2%。總體來看，隨著繼代培養代數的增加，各菌株的菌絲生長速率呈明顯下降的趨勢，來自于野生子實體的菌株表現生長速率下降的時間，比來自人工栽培子實體的菌株要慢。

2.2 繼代培養過程中菌落形態的變化

繼代培養過程中菌落形態的變化情況見圖2。

圖2 蛹蟲草不同菌株繼代培養過程中菌落形態變化（以09-40-4為例）

供試的5個菌株在繼代培養過程中菌落形態都發生了明顯的改變，主要表現為菌落顏色逐漸變淡和出現角突變。菌落顏色由橙色變成杏黃色或是由杏黃色變成淡檸檬黃色，特別是粉狀菌株在培養5代之后菌落邊緣開始形成白色絨狀的角突變。而菌落質地沒有發生明顯變化。

2.3 繼代培養過程中菌株產孢量的變化情況

繼代培養過程中菌株產孢量的變化情況見圖3。

圖3 蛹蟲草不同菌株繼代過程中產孢量的變化

來自于野生子實體的2個菌株在第1代時產孢量很大，但第5代時產孢量明顯下降，之后隨著培養代數的增加繼續減少，09-40-4和09-40-5第15代的產孢量與第1代相比分別下降了約88%和97%；來自于人工栽培子實體上的3個菌株，在培養過程中也出現了產孢量減少的情況，5E-10-2、5E-10-7以及5E-10-Z2第10代產孢量與第1代相比分別下降了約55%、67%和42%。

2.4 繼代過程中菌株子實體產生能力的變化情況

繼代過程中菌株子實體產生能力的變化情況見表2、圖4。

表2 供試菌株不同培養代數的子實體產生情況（鮮重）

圖4 蛹蟲草菌株繼代過程中子實體形成能力的變化情況（以 09-40-4×09-40-5 為例）

將培養1代后的2個相反交配型的菌株進行配對或將組織分離的菌株單獨培養，都能夠產生正常的子實體，產量也較高（表2），但培養5代后的菌株組合09-40-4與09-40-5的子實體產生明顯下降，或有些子實體發育不良，子實體上沒有子囊殼（圖4B），另一對菌株組合5E-10-2與5E-10-7甚至不產生子實體。培養第10代后的菌株全部喪失了產生子實體的能力，只長有類似于子實體原基的菌絲體（圖4C）。

3 討論

本研究除了1株組織分離的菌株外，其余4個菌株均是單子囊孢子的菌株，保證了初始菌株在遺傳上的單一。根據本試驗的觀察，隨著培養代數的增加，蛹蟲草的生物學性狀發生了明顯的改變，包括菌絲生長速率短暫升高之后逐步下降，菌落顏色逐漸變淡并有角突變出現，菌株產孢能力明顯減弱，子實體形成能力也逐漸減弱，由子實體產量減少發展為不能形成子實體。當然不同菌株生物學性狀發生改變的程度是有差異的，如菌株09-40-4和09-40-5配對相對比5E-10-2和5E-10-7配對所表現的 “退化”程度慢（表2）。因此，在實際生產中應該注重優良菌株的選擇和保藏，并盡量減少菌種在人工培養基上的培養代數，以防止或減緩菌種的 “退化”。蛹蟲草菌株在培養過程中除了上述生物學性狀的變化外，還表現在退化菌株的脫氫酶活性和在色度培養基中的脫色能力都明顯比正常菌株減弱[11]。但對于繼代培養過程中菌株生物學性狀的變化尤其是子實體形成能力 “退化”的機制還有待進一步深入研究。

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