外源性物質對Wnt通路抑制劑DKK的表達作用

臘 蕾* 班 武 任青青

（1 南方醫科大學南方醫院藥學部，廣東 廣州 510515；2 廣州軍區總醫院，廣東 廣州 510010；3 南方醫科大學藥學院，廣東 廣州 510515）

Wnt/β-catenin信號通路（Wnt通路）是調控細胞形狀、運動、黏附、增殖、分化等過程的主要通路之一，該通路的異常活化參與人類多種癌癥的發病過程，這種異常活化的Wnt通路，有可能產生抑制腫瘤細胞生長的作用[1,2]。

p53是與許多腫瘤發生密切相關的基因，p53突變或缺失也會引起腫瘤的發生，人類腫瘤中常有p53基因突變的發生，作為腫瘤抑癌基因，p53基因被譽為“分子警察”，在正常組織細胞的生長、發育與分化等過程中起重要作用，其主要生物學功能是維持細胞基因組的穩定，是一種十分重要的凋亡誘導蛋白。Wnt信號通路是一條進化上保守的信號傳導通路，其主要功能是促進細胞分裂，阻止細胞凋亡，在生物學功能上p53與Wnt通路恰好相反，關系不密切，但目前的研究表明，Wnt通路與p53之間的關系非常復雜，Reed KR等[3]研究發現，Wnt信號通路的激活可以導致p53蛋白表達增多，在p53陽性細胞中有Wnt通路抑制因子Dickkopf-1（DKK-1）的大量表達，另外，在抑制由Wnt通路誘發腫瘤的研究中，也發現p53活性是必須的[4]。可見，弄清楚p53與Wnt通路的關系對于闡明二者在腫瘤發病中所起的作用以及在腫瘤治療中的應用價值是非常有意義的。

近年來我們發現國際學術會已有對Wnt通路抑制劑的報道：WIF（Wnt inhibitory factor）-1，sFRP（secreted Frizzled-related protein），Cerberus，其中抑制劑DKK（Dickkopf）家族中研究最多的為DKK-1[5]，它的作用特征是能夠對頭部活動產生誘導作用，注射DKK-1mRNA導致一種“放大頭部”的顯型。它通過結合Wnt受體復合物的LRP5/LRP6（Low-density-lipoprotein-receptor-related proteins）成分，從而抑制Wnt信號通路。目前有關文獻對抑制劑DKK-家族的成員以及在生物機體內部的調控是如何表達的報導較多，對于它是否能夠受到外源性因素的影響還不是十分清楚，闡明這些問題對于抑制劑Dickkopf-1如何在細胞內外的調控機制是非常有意義的。因此，本文選擇了外源性物質抑癌基因p53和抗腫瘤藥阿霉素對Wnt通路抑制劑表達的影響，以了解外源性物質是否通過抑制劑介導Wnt通路的調控。

1 材料與方法

1.1 材料

Hep3B第二軍醫大學郭亞軍博士惠贈；Adp53深圳市賽百諾有限公司惠贈；小鼠抗人p53抗體為Santa公司產品；羊抗小鼠IgG-FITC為sigma公司產品；Trizol核酸蛋白分離液為Gibico公司產品；AMV酶、dNTP Mixture、Taq酶、Oligo（dT）18為大連寶生物工程有限公司產品。

1.2 HepG2、Lovo、Hep3B、U251細胞培養

該細胞于37℃、5%CO2培養箱中培養，生長于DMEM完全培養液中。

1.3 Adp53基因轉染

將細胞接種于6孔板中，加入感染液（Adp53），每15min搖晃一次，搖勻后放入培養箱中孵育，1h后除去感染液，放入培養箱中培養。

1.4 流式細胞術

細胞感染Adp53，經阿霉素作用，消化成單細胞懸液，以多聚甲醛固定，去上清后懸于山羊血清的染色液中半小時，加入兔抗人β-catenin抗體，小鼠抗人p53后室溫孵育1h，2次洗滌后加入羊抗小鼠-FITC，室溫孵育半小時后，過400目尼龍網，上機檢測。

1.5 反轉錄PCR

收集分別經轉染后轉染劑量為0.05、0.5、5、50pfu/cell和轉染時間為16、20、24、28、32、36、40h的各個劑量和時間點的肝癌細胞，按使用說明進行抽提細胞總RNA。DKK-1引物序列：上游引物5′-AGGCGTGCAAATCTGTCTCG-3′；下游引物5′-TGCATTTG GATAGCTGGTTTAGT-3′（502bp）；GAPDH引物序列：上游引物5′-CACAGTCCATGCCATCACTGC-3′，下游引物5′-GGTCTACA TGGCAACTGTGAG-3′（609bp）（上海博亞生物技術有限公司合成）；RT-PCR過程：按產品說明書操作，逆轉錄反應條件為42℃，60min。PCR條件為：94℃ 2min熱啟動，94℃ 1min變性，58℃ 1min退火，72℃ 1min延伸，反應35個循環。

2 結 果

2.1 Adp53的轉染

將轉染劑量為0（空白）、5pfu/cell時應用流式細胞術觀察Adp53的轉基因情況，從圖1可看出，對照組p53表達呈陰性，未有熒光量顯示，轉染Adp53 24h后平均熒光量增加了約50倍，96%以上的細胞p53表達呈陽性，表明p53基因轉染成功。

圖1 流式細胞術檢測p53蛋白的表達

2.2 在肝癌細胞（p53缺失）中Adp53誘導DKK mRNA的時效關系表達

為研究p53對抑制劑DKK的時效關系，我們觀察了轉染Adp53，不同時間后DKK表達，如圖2所示，抑制劑DKK表達水平20h后明顯增加，32h最高，36h、40h時表達水平逐漸回落，但仍高于對照組水平。

以上結果顯示外源性p53對抑制劑DKK的表達具有明顯的上調作用，那么除了p53之外，是否還有其他的外源性物質對抑制劑的表達具有作用哪？下面我們觀察了抗腫瘤藥阿霉素對抑制劑DKK表達的影響。

2.3 阿霉素對腫瘤細胞DKK mRNA表達的影響

在人神經膠質瘤細胞（U251，p53突變型）、人大腸癌細胞（Lovo，含野生型p53）、肝癌細胞（HepG2，含野生型p53；Hep3B，p53缺失）中加入阿霉素后與對照組相比DKK-1mRNA表達水平明顯增加。如圖3所示，結果表明抗腫瘤藥阿霉素能夠誘導抑制劑的表達。

圖2 肝癌細胞中Adp53誘導DKK-1基因表達的時效關系

圖3 化療藥阿霉素在腫瘤細胞中的DKK-1基因表達水平

以上結果顯示外源物質Adp53和阿霉素的導入對抑制劑DKK表達具有上調作用，為了進一步證實外源性物質對抑制劑的表達作用，下面又觀察Wnt通路的關鍵因子β-catenin表達水平的變化。

2.4 轉染Adp53后肝癌細胞（p53缺失）關鍵因子β-catenin時效關系的表達

為研究β-catenin表達的時效關系，我們觀察轉染Adp53后在肝癌細胞Hep3B（p53缺失）β-catenin不同時間的表達，如表1所示，隨著轉染時間的增加，在轉染時間為24h、36h、48h、60h時，β-catenin的陽性細胞百分數逐漸降低，表達水平下降，表明在p53誘導抑制劑DKK受到上調后，Wnt通路受到抑制而引起關鍵因子β-catenin的下調（經χ2檢驗，P＜0.05）。

表1 肝癌細胞中Adp53下調β-catenin表達的時效關系

2.5 加入阿霉素后在人肝癌細胞HepG2、Hep3B、人神經膠質瘤細胞U251中β-catenin的表達

如圖4、5、6所示，在腫瘤細胞中，加藥24h后β-catenin的陽性細胞百分比強度與對照組相比，表達水平降低。（經χ2檢驗，P＜0.05）。

以上結果顯示通過外源性p53和抗腫瘤藥阿霉素的導入，關鍵因子β-catenin的表達水平下降，在時間及劑量上β-catenin這種變化與p53和抗腫瘤藥阿霉素對抑制劑DKK具有上調作用是相吻合的，表明外源性p53和阿霉素能誘導DKK的表達，進而引起Wnt通路的抑制。

圖4 肝癌細胞(HepG2，wt p53)中阿霉素對β-catenin起下調作用

圖5 神經膠質瘤細胞(U251，mutant p53)中阿霉素對β-catenin起下調作用

圖6 肝癌細胞(Hep3B，p53 null)中阿霉素對β-catenin起下調作用

3 討 論

Wnt信號通路在生物發育、細胞轉運、腫瘤形成及細胞凋亡等生命過程中發揮重要的作用，其通路異常活化與腫瘤的發生與進展關系密切。正規的Wnt信號只有在卷曲蛋白和輔助受體低密度脂蛋白受體相關蛋白（low density lipoprotein receptor related protein，LRP）均與Wnt結合后通過其下游蛋白的磷酸化與去磷酸化過程來完成Wnt信號途徑的傳遞。在沒有Wnt信號刺激的情況下，胞質內的GSK-3β能與其它蛋白以復合物的形式磷酸化β-catenin，使β-catenin降解，β-catenin處于低水平狀態。在有Wnt信號刺激的情況下，由細胞分泌的Wnt蛋白與細胞表面受體FZD（frizzled protein receptor）和LRP5/6結合后，即激活細胞內的信號傳導，不能磷酸化β-catenin，導致β-catenin積聚進入細胞核，促進靶基因無限制轉錄，腫瘤細胞增殖。

本研究結果顯示，加入外源性物質p53后，在腫瘤細胞中，外源性p53對抑制劑Dkk在時效關系上具有明顯的誘導作用（圖2），加入阿霉素后，抑制劑DKKmRNA的表達水平下降（圖3），Wnt信號通路的關鍵調節因子β-catenin表達水平下降（見圖4、5、6），從而抑制Wnt通路，這說明化療藥阿霉素和外源性p53對DKK具有顯著的誘導作用。化療藥阿霉素的抗腫瘤作用可嵌入DNA的堿基對之間，使DNA鏈裂解，阻礙DNA及RNA的合成，而且，損傷的DNA能夠引起p53的表達，因此，p53-DNA-DKK三者之間是否存在著一定的相關性哪？實驗中，我們挑選了幾種不同p53狀態的細胞，結果表明，抑制劑DKK-1對p53野生型細胞、突變型細胞、完全缺失的細胞均有明顯的誘導作用，在抗腫瘤藥阿霉素的作用下呈現明顯上調的效果，說明外源性抗腫瘤藥阿霉素能夠誘導抑制劑DKK的表達，抗腫瘤藥誘導抑制劑DKK，很可能是它們抗腫瘤作用的其中一種方式，現有的實驗說明，抑癌基因p53和抗腫瘤藥阿霉素還可通過對抑制劑DKK的上調作用，從而抑制Wnt通路，抑制劑DKK可能是p53和阿霉素抗腫瘤作用的一個靶點，這很可能是p53和阿霉素抗腫瘤作用的另外一種方式。因此，通過對新作用環節的研究，進一步探尋抗腫瘤的新靶點是非常有意義的。

[1]Karim R,Tse G,Putti T.The signif i cane of the Wnt pathway in the pathology of human cancers[J].Pathology,2004,36(2):120-128.

[2]Peifer M,Polakis P.Wnt signaling in oncogenesis and embryogenesis-a look outside the nucleus[J].Science,2002,287(5458):1606-1609.

[3]Reed KR,Meniel VS,Marsh V,et al.A limited role for p53 in modulating the immediate phenotype of APC loss in the intestine[J].BMC Cancer,2008,8(3):162-165.

[4]Chen YW,Jeng YM,Yeh SH,et al.p53 gene and Wnt signaling in benign neoplasms:beta-catenin mutations in hepatic adenoma but not in focal nodular hyperplasia[J].Hepatology,2002,36(1):927-935.

[5]Yoshiaki K,Robert K.Secreted antagonists of the Wnt signaling pathway[J].J Cell Sci,2003,116(Pt 3):2627-2634.