中國鯉魚春季病毒血癥毒株糖蛋白基因的亞克隆表達與純化

張 琳,丁雅苓,陳建民,夏 春,2

(1.中國農業大學動物醫學院,北京 海淀 100193;2.農業部人畜共患病重點實驗室,北京 海淀 100193)

鯉魚春季病毒血癥(Spring Viremia of Carp,SVC)于2008年被我國農業部列為“中華人民共和國進境動物一類傳染病”[1]。這是新中國成立以來第一個也是惟一一個魚類病毒疫病被列為一類傳染病,其危害十分嚴重[2]。SVC主要發生于鯉科魚。該病感染率與致死率均高,主要流行于歐洲、中東地區和俄羅斯等國;美洲和亞洲的一些國家也時有發生[3]。由于SVC的危害性大,世界動物衛生組織(OIE)制定了必須申報制度。在我國,某地如果發生SVC,必須對該水域中的魚類進行撲殺。SVC是由SVC病毒(SVCV)引起的一種魚類傳染性急性出血性病毒病。SVCV屬彈狀病毒科、水皰性病毒屬。其基因組長約11019堿基,為不分節段的單鏈負股 RNA。SVCV病毒粒子主要編碼5種結構蛋白,分別為核蛋白(nucleoprotein,N),磷蛋白(phosphoprotein,P),基質蛋白(m atrix protein,M),糖蛋白(glycoprotein,G)和RNA聚合酶蛋白(RNA polymerase,L)[4]。其G蛋白是重要的免疫保護性抗原,決定了SVCV的血清型及毒株的分子特征[5]。

本文對SVCV-C1 G基因進行了亞克隆,表達并純化了其重組蛋白,構建了SVCV-C1 G系統進化樹,闡釋了中國分離株SVCV-C1 G與其他彈狀病毒糖蛋白的關聯性。為研制基因工程疫苗以及進一步深入開展SVCV分子病毒學研究奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 SVCV-C1 G基因由本實驗室保存。Hiload16/60 Superdex 75分子篩柱購于Amersham Bioscience公司。AKTA purifier純化系統購自GE公司。

1.2 SVCV-C1 G基因亞克隆 根據SVCV-C1序列(EU177782)設計了G蛋白的一對表達引物。上游引物P1序列為5′-AAT TCATATGT TTG TTCCATCCGGGCGGAA TA TATCAG-3′(包含 NdeⅠ酶切位點),下游引物 P2序列為5′-CCGCTCGAGAGTTCCCCACCCACTGACCCATTCT-3′(包含XhoⅠ酶切位點)。以實驗室已構建的pMD18T/SVCV-C1 G質粒為模板,采用 PCR方法進行擴增[5]。PCR反應條件為:98 C預變性5 min;94℃變性60 s,58℃退火60 s,72℃延伸90 s,共32個循環;再72℃延伸10 min,終止反應。

1.3 SVCV-C1 G表達載體的構建和序列分析 采用NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切PCR回收產物,再連入同樣雙酶切的 pET 21a中,構建原核表達質粒pET 21a/SVCV-C1 G。然后將重組質粒轉化BL 21(DE3)大腸桿菌感受態細胞。經鑒定,挑取陽性克隆進行測序。測序序列與 SVCV(ABB13500、AAW47746、CAA85735)、VSNJV(P04882)、ARV(AAA02764)、LBV(ABY86624)、VHSV(CAB07737)G蛋白進行同源性比對。然后進行系統進化樹分析。

1.4 SVCV-C1 G蛋白表達及SDS-PAGE分析將陽性測序菌液BL21(DE3)/pET 21a/SVCV-C1 G接種到LB(Amp)培養基中,37℃條件下,200 r/min培養至OD600值達到0.6,加入終濃度為1 mmol/L的IPTG,繼續培養4 h。同時設置重組菌和空質粒菌對照。離心收集菌體,進行SDS-PAGE分析。

1.5 SVCV-C1 G蛋白制備與純化 包涵體復性采用的體系和方法參照《雞β2-微球蛋白及其硒代衍生物的制備和晶體學研究》[6]進行。收集層析純化的峰值樣品進行SDS-PAGE鑒定。

2 結果

2.1 基因亞克隆和表達載體的構建 P1/P2引物PCR擴增后將回收產物插入p ET 21a中,構建原核表達質粒p ET 21a/SVCV-C1 G,酶切結果在1400 bp和5400 bp處分別呈現一特異性帶。SVCV-C1 G測序結果顯示,其全長1326 bp,編碼442個氨基酸,GenBank登錄序列號為 ABW24036。ABW24036與1.3中幾種不同種屬彈狀病毒進行同源性分析,表明屬內同源性(94.7%～99%)與屬間同源性(18.4%～32%)區別較大,但半胱氨酸、脯氨酸、甘氨酸殘基高度保守,同時含有兩個相對保守的主要疏水區,構成信號肽(1～21位氨基酸)和跨模區(464～484位氨基酸)。

2.2 SVCV-C1 G基因系統發育樹分析 采用ClustalW和MEGA2.0軟件制作系統進化樹,使用鄰位相連法(Neighbor-joining)。結果發現,SVCVC1 G(ABW24036)屬于彈狀病毒水皰病毒屬,為鯉春病毒 Ia基因亞型[7],如圖 1所示,與 USA株ABB13504和ABB13500兩株最近,進化方向一致,種間與PFRV進化關系最為相近,與ARV進化關系最遠。

2.3 重組蛋白表達 通過BL 21(DE3)原核系統在37℃誘導情況下表達的蛋白,經SDS-PAGE分析在49.5k Da位置處有明顯表達帶。表達蛋白占菌體總蛋白的32%。

2.4 重組蛋白純化與制備 包涵體提取后通過稀釋復性法復性,后將蛋白上樣至Hiload16/60 Superdex 75進行分子篩層析,蛋白以聚體形式存在,主峰樣品經SDS-PAGE分析驗證,大小49.5 kDa,純度可達到90%。

3 討論

通過對SVCV-C1 G的分析發現,不同彈狀病毒糖蛋白間的同源性相差較大。SVCV-C1 G與出血性敗血癥病毒(VHSV)G蛋白同源性僅有18.4%,但G蛋白序列中的半胱氨酸、脯氨酸和甘氨酸殘基卻高度保守[8]。此外,G蛋白序列內都含有兩個疏水區,分別構成信號肽和跨模區結構域,所在位置也相對固定[9]。系統樹顯示,同屬水皰性病毒屬的 PFRV、ISFV 、VSNJV、VSIV、VSAV 和SVCV同在一分支,而狂犬病病毒屬和諾拉彈狀病毒屬則處于另一分支,PFRV與SVCV進化關系最遠。

圖1 SVCV-C1G系統發育進化樹

G蛋白是SVCV免疫保護性抗原蛋白,可以誘導機體產生中和抗體。SVCV-G DNA疫苗也顯示出了明顯的保護效果[10]。彈狀病毒G蛋白可在病毒表面呈三聚體突起,與宿主細胞表面受體結合,誘導細胞內吞并與毒力密切相關[5]。本文采用p ET系統高效表達、純化了SVCV-C1 G。結果顯示,SVCV-C1 G占菌體總蛋白的約32%,經分子篩純化后純度可達90%。高純度的SVCV-C1 G為今后研發分子疫苗、制備單抗以及研究病毒結構提供了物質保障。

[1] 中華人民共和國農業部公告.第1125號:“一、二、三類動物疫病病種名錄”[EB/OL].http://ag ri.gov.cn/blgg/t20081223-1194404,htm,2008-12-11.

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