地黃蘇合香合劑對早期肝性腦病大鼠腦內外周型苯二氮受體的影響

劉赫，劉雁勇，楊楠，紀超，左萍萍，龔韜，廖磊，侯曉明，蔡哲

肝性腦病(hepatic encephalopathy,HE)是指發生于肝臟功能嚴重障礙引起的以代謝紊亂為基礎的中樞神經系統功能失調綜合征。發病初期以自主活動減少、定向力障礙為主；繼而產生神經精神癥狀，如性格改變、行為異常等[1]。它是慢性肝病及嚴重肝病患者常見的并發癥和死亡原因，病死率高達60%～80%，嚴重影響患者的生活質量，其發病機制目前尚未完全闡明。外周型苯二氮受體(peripheral-type benzodiazepine receptors,PBRs)與中樞γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid,GABA)相關的苯二氮受體不同，位于星形膠質細胞的線粒體膜上。在肝硬化伴肝性腦病患者腦內PBRs增加，并有實驗證明其增加可能是慢性高氨血癥的結果[2]。PBRs的作用受到安定結合抑制劑(diazepam binding inhibitor,DBI)的調節，后者是星形膠質細胞中的一種內源性神經肽。DBI作用于PBRs后刺激神經激素產生，并能擴大GABA的作用。在肝性腦病的動物模型中，無論是DBI成分還是PBRs的密度均有增加[3]。本研究在前期工作的基礎上，選擇地黃和蘇合香兩味藥組成的“地蘇合劑”，采用四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl4)誘導大鼠早期肝性腦病模型，通過放射性配基受體結合實驗，得到PBRs的動力學參數，以此探討中藥對化學性肝損傷誘導的肝性腦病早期的防治作用及其相關機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 SPF級雄性Wistar大鼠60只，由北京大學醫學部提供，動物合格證號：SCXK(京)2007-0001。飼養條件：分籠飼養，每籠5只，自由飲食、飲水，自然晝夜節律光照，室溫22℃～25℃，相對濕度40%～60%。在適應環境1周后隨機分為對照組、模型組、陽性藥組、低劑量組、中劑量組和高劑量組，每組6只。

1.2 藥品、試劑與儀器 本實驗采用的“地蘇合劑”含地黃提取物(水蘇糖含量49.88%，梓醇含量2.56%)及蘇合香，均由北京市中藥研究所中藥化學室提供；乳果糖(杜秘克)：規格：15 ml/袋，含乳果糖10 g，蘇威制藥有限公司，批號：335202；CCl4：北京市化學試劑公司，批號：20090119，實驗前用滅菌的橄欖油配成50%濃度。[3H]PK11195：放射性比活度83.5 Ci/mmol,PerkinElmer Life Science Co.,USA，非標記PK11195：Sigma Chemical Co.,USA，閃爍液以及1450LSC&液體閃爍技術儀：PerkinElmer Life Science Co.,USA。

1.3 實驗方法

1.3.1 模型制備及給藥 除對照組外，其余組采用經典的CCl4誘發肝纖維化模型，即灌胃給予50%CCl41 ml/kg，每周2次，連續造模12周[4]。在造模的同時，陽性藥組給予乳果糖6 g/kg，低劑量組給予地黃提取物0.5 g/kg+蘇合香0.008 g/kg，中劑量組給予地黃提取物1 g/kg+蘇合香0.016 g/kg，高劑量組給予地黃提取物2 g/kg+蘇合香0.032 g/kg。

1.3.2 皮層線粒體制備 造模12周結束后，每組取部分大鼠斷頭，迅速剝離顱骨，分離出皮層，每只大鼠取1/4腦皮層按1∶9的比例投入冰冷的pH 7.4勻漿緩沖液中冰浴電動勻漿。每組動物的勻漿液混合至一管，于4℃，700 g離心10 min。將上清液轉移至干凈離心管，4℃，16000 g離心10 min。收集沉淀，加入0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液8 ml重新懸浮沉淀，4℃，12000 g離心30 min，洗滌沉淀2次，收集沉淀物即線粒體。

1.3.3 放射配基受體結合飽和實驗 取線粒體于4℃下解凍，加入預冷的0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液電動勻漿，調整每管蛋白質濃度約為0.5～1.5 mg/ml。每管反應體系總體積均為 300μl，其中膜懸液 100μl。非特異結合管中加入100μl非標記PK11195。每管均加入0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液補足總反應體積。4℃孵育10 min 后，每管加入 10μl[3H]PK11195，在 0.1～3.5 nmol/L范圍內設置7個濃度梯度。每個樣本均為平行3管，4℃孵育1 h后，迅速真空抽濾到玻璃纖維素濾膜上，用20 ml預冷的0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液重復洗滌濾膜兩次終止反應。濾膜移至干凈管中，加入2 ml甲苯閃爍液。暗適應至少8 h以減少化學發光，于液閃儀上測其每分鐘計數值(counts per minute,cpm)值，每個標本計數30 s。為計算解離平衡常數(Kd)值和最大結合容量(Bmax)值，采用Scatchard方法作圖進行直線回歸，直線斜率為-1/Kd，橫軸截距為Bmax。

2 結果

通過對大鼠進行行為學和血氨等指標的檢測，可以判定早期肝性腦病模型成功建立[4]。

放射性配基受體結合實驗中，大鼠腦皮層線粒體結合活性見表1。模型組大鼠腦皮層線粒體PBRs結合活性較對照組明顯升高(P＜0.01)，陽性藥組大鼠腦皮層線粒體PBRs結合活性較模型組明顯降低(P＜0.01)，中、高劑量組大鼠腦皮層線粒體PBRs結合活性較模型組降低(P＜0.05)。

在受體飽和實驗中，各組大鼠腦皮層線粒體PBRs Kd值無顯著性學差異(P＞0.05)。模型組大鼠腦皮層線粒體PBRs的Bmax值較對照組明顯升高(P＜0.01)，陽性藥組和高劑量組大鼠Bmax值較模型組明顯降低(P＜0.01)。見表2。

表1 各組大鼠腦皮層線粒體結合活性(fmol/mg prot.)

表2 各組大鼠腦皮層線粒體PBRs受體飽和實驗

3 討論

肝性腦病是各種急、慢性肝衰的神經精神系統并發癥，癥狀多種多樣，其發生的確切機制尚未完全明了，不過，氨中毒學說已被廣泛接受。已有報道，在實驗性急性肝衰竭中，氨刺激PBRsmRNA和PBRs結合位點表達增加。同樣，暴露于氨或錳的星形膠質細胞PBRs結合位點表達也增加，提示血氨增高和(或)錳沉積可能是PBRs結合位點增加的原因[5-10]。PBRs激活后能誘導某些神經類固醇的合成[11]，神經性類固醇合成的增加在肝性腦病的發病機制中發揮重要作用。

中樞神經系統內的PBRs主要存在于外周及中樞神經系統所有組織的線粒體膜上[12]，并主要集中在線粒體內膜與外膜相接觸的部位，即線粒體通透性轉換孔[13]，參與調控神經類固醇的合成以及神經元的凋亡過程[14-17]。最近的研究表明，PBRs在各種中樞神經系統疾病，如神經變性、腫瘤、炎癥、脫髓鞘、腦缺血、腦創傷、癲癇和肝性腦病中表達明顯上調。因此PBRs已成為反映體內外神經病理學改變的一種敏感而特異的定量指標。深入研究其作用機制具有重要理論意義和實際意義。

線粒體PBRs具有廣泛的生物學功能，它與激素產生的調控、細胞生長與分化的調節、凋亡的發生、線粒體膜電位的調控、線粒體呼吸功能的調節、免疫系統的反應、電壓敏感型鈣通道的調控、應激反應、小膠質細胞的激活、腫瘤細胞的分化均密切相關[18]。在體內，PBRs主要通過與其特異性配體結合而發揮多種生理功能。它可促進膽固醇跨膜轉運進入磷脂膜，從而促進髓鞘形成；細胞因子通過刺激星形膠質細胞PBRs的表達來促進膠質瘢痕的形成，提示PBRs參與神經修復過程。PBRs表達增加能夠很好地反映局灶性腦缺血半暗帶以及損傷神經元通路順行和逆行遠隔區域小膠質細胞增生和活化。當持續異常的信號輸入導致神經網絡長期改變時，經突觸傳遞的區域也出現膠質活化反應。因此，PBRs表達增加不僅是對組織損傷的反應，而且是對疾病的適應和神經網絡重建過程的標志[19-20]。在線粒體PBRs的功能中，與甾體類激素合成的關系是最為人們所熟識的，膽固醇從線粒體膜外轉運至膜內的過程決定著類固醇和膽汁酸的合成速度[21]。

當前，放射性配基受體結合分析法仍然是神經科學研究中的重要手段之一[22-23]。我們采用與PBRs具有高特異拮抗活性的[3H]PK11195配體進行受體飽和實驗并做Scatchard曲線分析。結果顯示，模型組大鼠腦皮層線粒體PBRs結合活性和代表受體數量的Bmax值較對照組均明顯升高，地蘇合劑中、高劑量組結合活性較模型組降低，高劑量組大鼠Bmax值較模型組明顯降低。Bmax值越大，受體數量或密度越大。本實驗證實，肝性腦病大鼠腦皮層PBRs可能存在著受體表達數量增加，表明[3H]PK11195結合量升高可作為神經損傷的一種標志，并可能成為用以解釋藥物作用的新靶點[24-25]。

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