榆樹皮粗多糖組成及體外抗氧化作用

楊明非

(東北林業(yè)大學，哈爾濱，150040)

多糖是一類天然大分子化合物，其作為藥物始于1943年。之后數(shù)十年的研究逐漸發(fā)現(xiàn)多糖具有復雜的、多方面的生物活性和功能，多糖作為廣譜免疫促進劑引起了人們極大的興趣。特別是近十年來人們對糖的認識有了質(zhì)的飛躍，現(xiàn)確定植物多糖的主要功能有：調(diào)節(jié)免疫、抑制腫瘤、延緩衰老、降血糖等作用。因此，對多糖類的研究再次成為人們關(guān)注的焦點。榆樹皮中就含有大量的黏液質(zhì)(植物多糖)。榆樹(Ulmus pumila L.)在我國自然分布較廣，且耐旱、耐寒、耐瘠薄。榆樹根系發(fā)達，抗風保土力強，在較干旱的貧瘠荒丘坡地都可較好生長，可謂資源豐富。榆樹皮又稱榆白皮，主要功用有：利水、通淋、消腫等，為常見中藥。已知榆樹皮中的成分有：β-谷甾醇、植物甾醇、豆甾醇、鞣質(zhì)、樹膠及脂肪油等［1］。但是對榆樹多糖的組成、作用等研究尚未見報道。本文從榆樹皮中提取榆樹多糖，以確認榆樹皮多糖的組成，進而研究它的抗氧化活性，為榆樹皮的進一步研究、開發(fā)應用提供科學的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試材

儀器：TU—1901雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器公司);Avatar360型傅立葉變換紅外光譜儀(Thermo Nicolet);6890N氣相色譜儀(Agilent Technologies)。

試樣：鮮榆樹皮剪段，低溫脫水并干燥粉碎(含水率41.13%)，采用索氏提取法在90℃下用無水乙醇除雜質(zhì)，備用。

試劑：所用試劑均為分析純或生化試劑。

1.2 多糖提取

榆樹皮多糖以水提取，方法參照文獻［2］：精稱10 g干樣，料液比1 g∶70 g，80℃水浴回流浸提3 h，冷卻，過濾，Sevage法除蛋白，濃縮至原體積的1/7，加入4倍體積無水乙醇，醇析沉淀，靜置過濾，留濾渣，低溫干燥，制得粗多糖。

1.3 粗多糖成分分析

粗多糖紫外可見光譜分析：配制質(zhì)量濃度為6.4 g·L-1粗多糖水溶液。波長掃描范圍：200～800 nm。

紅外光譜表征：用KBr壓片法測試榆樹粗多糖紅外光譜圖。

粗多糖組成的氣譜分析參照文獻［3］進行。

①粗多糖水解。H2SO4水解法，得水解單糖備用(衍生化略)。

②標準糖衍生化。稱取木糖、半乳糖、甘露糖、甘露醇、阿拉伯糖、葡萄糖各約10 mg，分別加入20 mg鹽酸羥胺、20 mL吡啶，振蕩，90℃水浴30 min，取出冷卻后加2.0 mL乙酸酐于90℃水浴中?；?0 min，濃縮至5 mL，冷卻。

③肌醇六乙酸酯(內(nèi)標物)的制備。用肌醇配制成質(zhì)量濃度為1 g·L-1的甲醇溶液，制備同②。

④色譜試樣準備。取各標準糖衍生物、粗多糖水解衍生物適量，分別加入內(nèi)標物(肌醇六乙酸酯)適量，混勻備用。

⑤氣譜條件。氣譜柱型號PH—5，30 mm×0.25 mm×0.25μm。程序升溫：40℃ 5 min，8℃·min-1升溫至260℃，保持30 min。汽化室溫度250℃，F(xiàn)ID為250℃，載氣為N2，進樣量0.5 μL。

采用標準糖定性內(nèi)標法定量，分析榆樹皮多糖組成。

1.4 粗多糖抗氧化性

1.4.1 普魯士藍法比較粗多糖與Vc還原能力

粗多糖還原能力測定方法參照文獻［4］進行。

取用不同質(zhì)量濃度的粗多糖溶液及Vc溶液(Vc為對比物)，加入各試劑啟動反應，放置10 min，于700.00 nm處測定其吸光度A。A值越大，樣品的還原能力越強。

1.4.2 粗多糖與Vc清除羥自由基(Smirnoff法)比較

粗多糖清除羥自由基試驗方法參照文獻［5］、［6］進行。

①分析波長。取用質(zhì)量濃度分別為2.210 g·L-1的粗多糖溶液及0.4050 g·L-1Vc 適量，依次加入5.00 mL 9.0 mmol·L-1FeSO4、5.00 mL 9.5 mmol·L-1水楊酸—乙醇溶液，用蒸餾水補齊體積至 15.00 mL，搖勻，再加入 8.8 mmol·L-1H2O2溶液5.00 mL啟動反應，搖勻后于37℃條件下反應30 min，迅速在紫外—可見分光光度計上掃描，波長掃描范圍是200.00～800.00 nm。粗多糖溶液及Vc均不引起特征吸收峰位移，確定分析波長為525.00 nm。

②羥自由基生成時間。試驗步驟如①，測定反應時間為0～60.0 min時段的吸光度A525.00nm。反應于15 min后趨于穩(wěn)定，時間確定為15 min。

③榆樹粗多糖與Vc清除羥自由基比較。粗多糖樣品對羥自由基的清除能力按下式計算：SA=((A0-(Ai-Ai0))/A0)×100%。式中：A0為總自由基的吸光度;Ai為粗多糖消除自由基后的吸光度;Ai0為粗多糖本底吸光度。

①掃描時間段。從加入鄰苯三酚溶液1 min后計時，20 s/次，連續(xù)掃描共 20 min，測定 A319.00nm。

②粗多糖對超氧自由基清除作用。取質(zhì)量濃度為1.476 g·L-1粗多糖溶液分別為 0、3、5、8、10、13、15 mL，測定各自氧化速率。

2 結(jié)果與分析

2.1 粗多糖光譜分析結(jié)果

按1.2中的方法提取粗多糖，其提取率為116.3 mg·g-1。用此粗多糖測定紫外可見光譜，見圖1。由圖1可見：粗多糖溶液在260 nm處無核酸吸收;在280 nm處無蛋白吸收。說明粗多糖無核酸、無蛋白干擾，較純。

圖1 榆樹皮粗多糖水溶液紫外光譜圖

用KBr壓片法獲得榆樹粗多糖紅外光譜圖(圖2)。圖2中：3 419 cm-1(寬峰)為糖類等O—H伸縮振動;1 417 cm-1為C—O伸縮振動;1 326 cm-1為C—H變角振動，這是由D—葡萄糖、D—甘露醇、D—木糖和半乳糖醛酸組成糖類的特征吸收峰;1 070 cm-1處雙峰為呋喃糖苷的特征吸收;603 cm-1為O—H的外平面振動峰。紅外譜圖表明該物質(zhì)是多糖［6-7］。

2.2 粗多糖組成的氣譜分析

肌醇衍生化制備肌醇六乙酸酯(內(nèi)標物)經(jīng)氣譜分析為單峰，相對含量大于99.5%，可作內(nèi)標物。榆樹皮粗多糖色譜分析表明，粗多糖由6種單糖組成。定性、定量結(jié)果見表1。

2.3 粗多糖與Vc還原能力的比較

榆樹粗多糖具有很強的還原能力，且還原能力隨質(zhì)量濃度增加而明顯遞增。榆樹粗多糖質(zhì)量濃度低于0.221 0 g·L-1時，其還原能力比對照物Vc差;當粗多糖質(zhì)量濃度大于0.441 9 g·L-1時，其還原能力要強于同等質(zhì)量濃度的Vc;質(zhì)量濃度在0.6～1.5 g·L-1時，榆樹粗多糖的還原能力比Vc高出50%～70%，還原能力很強。試驗結(jié)果見表2。

圖2 榆樹皮粗多糖紅外光譜圖

表1 粗多糖水解單糖定性、定量結(jié)果

表2 榆樹粗多糖與Vc還原能力

2.4 粗多糖與Vc清除羥自由基的比較

清除羥自由基的分析波長為525.00 nm。羥自由基生成時間在反應15 min后趨于穩(wěn)定，測試時間確定為15 min。榆樹粗多糖與Vc清除羥自由基的比較結(jié)果見表3。

由表3 可見，Vc 質(zhì)量濃度從0.10 g·L-1增加到0.25 g·L-1時，對羥自由基的清除率陡然上升，之后趨于平緩。榆樹粗多糖質(zhì)量濃度從0.2～0.52 g·L-1是穩(wěn)步上升的，但是對羥自由基的清除率遠不如Vc。

2.5 粗多糖清除超氧自由基(O-2·)

采用鄰苯三酚自氧化法測定粗多糖清除超氧自由基(O-2·)，其中間產(chǎn)物的積累在滯后30～45 s時與時間呈良好的線性關(guān)系，該有色產(chǎn)物在319 nm處有強烈的紫外吸收，見圖3。

清除超氧自由基的反應在0～5 min時可近似表示為一元線性方程(y=0.115 5x+0.164 1;相關(guān)系數(shù) R2=0.994 2)，確認掃描時間段為0～5 min。

不同體積下粗多糖對超氧自由基清除作用的各自氧化速率(各自氧化曲線方程的相關(guān)系數(shù)R2均大于0.99)見表4。

表3 榆樹粗多糖與Vc清除羥自由基比較

圖3 榆樹皮粗多糖清除超氧自由基分析波長

3 結(jié)論

榆樹皮中含有較多的多糖。以水提取獲得的粗多糖質(zhì)量分數(shù)為116.3 mg·g-1。氣譜標準物定性表明，粗多糖由阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖和甘露醇組成，定量分析結(jié)果分別為：168.7、182.2、120.1、66.0、221.6、141.8 mg·g-1，回收率達90.04%。其中的甘露糖或許與榆樹皮具有利水、通淋等功能相關(guān)聯(lián)。

表4 榆樹皮粗多糖清除超氧自由基

榆樹皮粗多糖還原能力比還原能力很強的陽性對照物Vc高出50%～70%。當粗多糖質(zhì)量濃度大于0.211 0 g·L-1時，對羥自由基有明顯的清除能力，最大清除率為59.67%，但遠不如對照物Vc。

榆樹粗多糖具有很強的還原能力，對羥自由基和超氧自由基在一定程度上有抑制和清除作用，有望作為天然抗氧化劑和功能性食品而得到開發(fā)應用。

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