工業(yè)微生物混合發(fā)酵的研究進展

朱 博，李 強

（江蘇科技大學，江蘇 鎮(zhèn)江212018）

1 引言

人類對微生物的利用經歷了天然混合培養(yǎng)到純種培養(yǎng)2個階段。過去的多數發(fā)酵食品都來源于混合發(fā)酵，由于多菌發(fā)酵是一個完整的或接近完整的生物體系，體系中的微生物之間大多數具有生長代謝協調作用。自從純種分離技術被廣泛應用以來，人們研究的重點、焦點似乎都在單一的菌種上，忽略了天然發(fā)酵的模式，那就是生存環(huán)境的完整性和協調性。利用混合菌種發(fā)酵生產飲料正是利用幾千年以來各菌種之間的共生性。純培養(yǎng)技術使得研究者擺脫了多種微生物共存的復雜局面，能夠不受干擾地對單一目的菌株進行研究，從而豐富了我們對微生物形態(tài)結構，生理和遺傳特性的認識。但是，在長期的實驗和生產實踐中，人們不斷地發(fā)現很多重要生化過程是單株微生物不能完成或只能微弱地進行的，必須依靠兩種或多種微生物共同培養(yǎng)完成。微生物混合培養(yǎng)或混合發(fā)酵已越來越被人們所重視。

2 混合發(fā)酵生產功能性飲料

目前混合發(fā)酵在功能性飲料的開發(fā)和生產方面有廣泛的應用。根據國際飲料行業(yè)協會的新規(guī)定，功能性飲料是指具有保健功能的軟飲料。目前市場上的功能性飲料主要分為3類，即運動飲料、能量飲料和其他飲料，其大多含有氨基酸、礦物質，以及各種維生素等人體所需物質。這些飲料的開發(fā)多數采用了混合發(fā)酵技術，也有部分是采用直接從生物體提取和單菌發(fā)酵方法的。隨著我國經濟的快速發(fā)展和人民生活水平的不斷提高，飲料消費迅速增加。據有關資料顯示，1980年我國飲料產量僅28萬t，1995年則猛增到1 000萬t，2005年達到2 000萬t，25年間平均以26.7%的速度增長。如此巨大的飲料市場，發(fā)酵功能性飲料必須占有一席之地。據國家統計局、中國飲料工業(yè)協會、中國食品工業(yè)協會、中國海關、中國經濟信息中心、中國競爭情報網、中國食品商務網、全國及海外500多種相關報紙雜志的基礎信息等公布和提供的大量資料顯示，中國飲料市場成為中國食品行業(yè)中發(fā)展最快的市場之一。2003年中國飲料產量2373萬t，比2002年增長16.84%。實現工業(yè)總產值（當年價）813.87億元，銷售收入774.42億元，分別比上年增長40.12%和40.41%。以“紅牛”“脈動”等新一代品牌為代表的功能性飲料已被廣大消費者所接受，并在健康潮中掀起一股功能性飲料的熱潮。就我國目前的飲料市場來看，功能性飲料正處于黃金發(fā)展時期，具有極大的開發(fā)空間［1］。

3 微生物混合培養(yǎng)生產藥品

3.1 維生素的混合發(fā)酵生產

維生素C二步發(fā)酵是混合發(fā)酵的典型實例。這種方法是由中科學院微生物所和北京鑭藥廠合作，于20世紀70年代初發(fā)明的。其第2步發(fā)酵由氧化葡萄糖酸桿菌和巨大芽孢桿菌等伴生菌混合發(fā)酵完成，其中小菌為合成維生素C前體2-酮基-L-古龍酸（2KGA）的菌株，但很難單獨培養(yǎng)，且單獨培養(yǎng)產酸能力很低；大菌單獨培養(yǎng)容易，但不產生2-KGA，與小菌混合培養(yǎng)時不僅可促進小菌生長，而且能大大增強小菌的產酸能力［2］。能與小菌混合培養(yǎng)合成2-KGA的伴生大菌有很多，除巨大芽孢桿菌外，還有蠟樣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌地衣芽孢桿菌，蘇云金芽孢桿菌等，某些酵母亦有該作用。有關研究表明，大菌為小菌提供某種生長因子促進其生長，并且提供某些生物活性物質協助小茵合成2-KGA，二菌混合培養(yǎng)呈互生關系［3］。通過調節(jié)二菌比例、pH值、溫度及溶氧量等因素，可使混合菌達到較適的生態(tài)狀態(tài)，發(fā)揮較高的生產效能。二者間的關系和作用機制正在進一步深入研究中。此外維生素B12可利用謝氏丙酸桿菌和馬鈴薯芽孢桿菌或大腸桿菌的混合培養(yǎng)生成。

3.2 抗菌肽的生產

乳酸菌素是一種由乳酸菌屬菌株產生的抗菌肽類，可抑制多種革藍氏陽性菌的生長，已被50余個國家用作食品保鮮劑［3］。1999年Shimizu等［4］報道，以Lactococcus lactis和Kluyveromyces marxianus混合培養(yǎng)可有效地生成乳酸菌素，這主要是由于Kluyveromyces marxianus可通過消耗前者產生的乳酸控制發(fā)酵體系的pH值，從而使乳酸菌素的產率維持高水平。

3.3 甾體轉化

多種甾體類藥物的轉化也是利用混合菌培養(yǎng)實現的。諾卡氏菌和節(jié)桿菌培養(yǎng)用于5α-Δ9（11）-16β-甲基-3β，17α，21-羥基-孕甾烯-3β，21-雙醋酸酯-20酮和5α，17α-甲基-17β羥基-雄甾-3酮的1，4位上的脫氫轉化［4］簡單節(jié)桿菌和玫瑰產色桿菌的混合培養(yǎng)也可用于甾體轉化。

4 微生物混合培養(yǎng)用于生物降解

蛋白質是配合飼料中的主要營養(yǎng)成分，一般占20%左右。隨著畜牧業(yè)的迅猛發(fā)展，對飼料蛋白的需求量日益增加。因此尋求新的飼料蛋白來源便顯得十分重要。我國薯類作物產量很高，但因其本身蛋白含量很低，直接用作飼料其生物效價不高通過微生物轉化技術可由豐富的薯類資源得到菌體菌蛋白飼料，從而可在一定程度上緩解日益突出的飼料蛋白短缺問題。對淀粉質原料而言，通常采用的工藝是原料先經酸法或酶法糖化等預處理，將淀粉降解為可發(fā)酵性糖，然后再接種相應的高蛋白產生菌合成微生物菌體蛋白。為簡化生產工藝，直接采用具有淀粉分解能力的菌種發(fā)酵生產蛋白飼料已日益受到重視。

我國是蛋白質飼料資源短缺的國家，目前蛋白質飼料年缺口約為1 500萬t。據預測2010年到2020年我國蛋白質飼料資源需求分別為6 000萬t和7 200萬t［5］。目前我國發(fā)酵工業(yè)的廢菌渣和糟渣類農副產品下腳料以及廢棄物大多沒有充分利用，這不僅造成資源浪費，而且造成環(huán)境污染［6～13］。現在生產主要是以食用菌生產過程中的廢菌渣為主要基質，篩選適合分解利用廢菌渣的多種大型食用真菌和酵母菌，采用單獨培養(yǎng)和混菌共同發(fā)酵工藝來生產飼料蛋白，以實現廢棄物質資源化和物資的循環(huán)再生，減少環(huán)境污染。

4.1 對原油的降解

生物修復是治理土壤石油污染的重要方法，主要原理是微生物利用石油作為碳源進行同化降解，使其轉變?yōu)闊o害的無機物質。據文獻報道，單菌株所能代謝的石油組分有限，大多數石油降解菌株只能代謝一種或幾種石油烴。但經過混合菌對原油的降解及其降解性能的研究，發(fā)現經馴化后的烷烴降解菌GS3C、菲降解菌GY2B、芘降解菌GP3A和GP3B對原油都具有一定的降解效果。GS3C能基本去除原油中的直鏈烷烴化合物，GP3A對C＜25的中短鏈烷烴化合物有較好的降解效果。構建的混合菌組G1、G3、G8、G11的降解效果較單一菌株有明顯的提高，去除率都達到了50%以上，能基本去除原油中的直鏈烷烴類化合物［14］。

4.2 對生活垃圾的降解

世界每年產生大量生活垃圾，處理方法主要是堆埋和焚燒，占用土地和浪費能源，既污染環(huán)境又帶來一定危害。生活垃圾在經過發(fā)酵后可作為有機肥料，但在一般條件下，其發(fā)酵時間長且肥效低，影響了其實際應用［15］。

有研究表明纖維素分解菌可混合培養(yǎng)，自生固氮菌利用纖維素分解菌分解纖維產生的葡萄糖作為碳源，纖維素分解菌利用固氮菌固定的氮作為氮源，兩者相互利用、相互依存，進行生長和繁殖。兩者混合培養(yǎng)的菌數和發(fā)酵液總含氮量明顯高于各自單獨培養(yǎng)。自生固氮菌與纖維素分解菌的混合菌液作用于生活垃圾，可大大提高生活垃圾的降解速度，同時其降解物的含氮量也有明顯的提高。用這種方法處理生活垃圾既可以提高生活垃圾的降解速度又使其含氮量增加，提高了肥力，同時其降解物中含有大量的有生物活性的固氮菌及纖維素分解菌，所以是一種優(yōu)良的生物活性肥料。將其施用于土壤中，既增加土壤的肥力，又增加土壤中固氮菌及纖維素分解菌的數量，有利于土壤中有機質的分解及土壤自生固氮，進一步增加土壤肥力，改良土壤，減少化肥的施用，有利于環(huán)境保護［16］。

4.3 氨基多糖生物降解氨基多糖

氨基多糖主要以幾丁質和脫乙酰幾丁質的形式存在于節(jié)肢動物外骨骼和真菌細胞壁中，在自然界中的含量僅次于纖維素。利用微生物對氨基多糖進行降解和轉化，有可能生成具有生物功能的活性糖蛋白。王士奎以Beauveria Bassiana LB90為氨基多糖降解菌，以Candida sp.LB50作為氨基糖轉化菌，建立了氨基多糖混合菌生物降解和轉化模型。與純培養(yǎng)比較，粘度下降比率提高23.0%，可溶性糖含量增加167.7g／mL，兩菌呈互生關系［17］。

5 混合發(fā)酵開發(fā)清潔新能源

5.1 沼氣發(fā)酵中的作用

沼氣發(fā)酵是由多種產甲烷菌和非產甲烷菌混合共同發(fā)酵完成的。我國是農業(yè)大國，每年產農作物秸稈7億t以上，禽畜糞便大約1.4億t。隨著農村經濟發(fā)展和農業(yè)結構調整，牲畜養(yǎng)殖已經由過去的農戶分散養(yǎng)殖過渡為集中養(yǎng)殖，并且大多集中在大城市附近，這必將造成農村戶用沼氣池發(fā)酵原料的短缺。因此，尋求新的發(fā)酵原料將是亟待解決的問題。然而單一以秸稈作為發(fā)酵原料，由于其碳氮比高、速效養(yǎng)分含量低、纖維木質素含量高，表面有一層蠟質，不利于微生物的附著，且降解率低、厭氧消化時間長、易出現漂浮分層，一直不能被廣大農民所接受。將糞便和秸稈混合發(fā)酵，可以有效彌補秸稈作為發(fā)酵原料的弊端［18～19］。

5.2 乙醇發(fā)酵

作為可更新可持續(xù)的生物能源，生物酒精是經濟高速發(fā)展過程中替代傳統石油燃料能源的最佳選擇之一。把纖維素作為可更新資源通過微生物降解轉化生成糖類，然后糖類進一步發(fā)酵轉化成液體燃料具有廣闊的應用前景［20～23］。然而，纖維素酒精的規(guī)模工業(yè)化生產還面臨很多嚴峻的實際問題，其主要問題之一就是微生物對纖維素的降解效率以及糖類發(fā)酵轉化成酒精的效率太低［20，21］。研究表明，熱纖維梭菌（Clostridiumthermocellum）是一種高效的纖維素降解細菌，但其酒精生產效率較低［22，23］；嗜熱厭氧乙醇菌（Thermoanaerobacterethanolicus）不能降解纖維素，但其能夠有效的發(fā)酵糖類而轉化為酒精。因此對兩者進行混合培養(yǎng)，可以利用熱纖維梭菌高效降解纖維素轉化成糖類，然后糖類可以作為嗜熱厭氧乙醇菌的底物通過發(fā)酵轉化成酒精，這樣一個穩(wěn)定的混合培養(yǎng)體系可以作為纖維素酒精工業(yè)化生產微生物群落較好的選擇。本研究主要以熱纖維梭菌和嗜熱厭氧乙醇菌為對象，以Solka Floc為底物纖維素，系統分析了熱纖維梭菌純培養(yǎng)以及熱纖維梭菌和嗜熱厭氧乙醇菌混合培養(yǎng)對纖維素酒精生產能力、纖維素降解能力及終產物分布的影響，以期為纖維素酒精工業(yè)化生產提供理論依據。

6 結語

雖然微生物混合發(fā)酵技術的部分成果已成功應用于部分工業(yè)生產，但在大多數混合菌體系中，菌間相互作用機制和發(fā)酵產物對于各種混合菌之間的影響的研究還很少。同時對于菌株混合時的安全性還沒有系統的評估和研究。混合發(fā)酵關鍵是摸索pH、溫度、混合比例、菌株混合時間等多菌種的共同培養(yǎng)條件，從而確定菌株發(fā)揮最大協同作用的結合點。為了使混合發(fā)酵能夠更好地應用于工業(yè)發(fā)酵生產，使其最終具有良好的大規(guī)模生產的工業(yè)應用前景。針對目前混合發(fā)酵的隨機組合和盲目的發(fā)酵實驗，需要深入研究并且建立快速有效的混合菌發(fā)酵模型是非常必要的。因此，如果從生理、代謝和遺傳角度對混合菌間關系和協同作用機制進行深入研究，對混合菌培養(yǎng)的理論和應用都將有巨大的突破。所以未來的研究重點可能集中在多菌組合模式、篩選適合菌株，并且優(yōu)化混合培養(yǎng)的條件。混合發(fā)酵有廣闊的發(fā)展空間，在工業(yè)發(fā)酵中如果得以合理的運用，就必定可以提高生產效率與產品質量，為實現綠色無污染生產提供了新的發(fā)酵模式。

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