電針“百會、風府”穴對腦I/R損傷大鼠海馬區CPG15表達影響的實驗研究※

● 唐曉敏 秦正玉 何宗寶 王家琳 吳生兵 汪克明

缺血性腦卒中是由于腦部血液供應障礙，缺血、缺氧而引起的局限性腦組織的壞死或腦軟化。本病屬中醫學“中風”的范疇，源于《內經》對中風病因病機的認識。針灸在治療缺血性腦卒恢復期的治療中具有優勢，一定程度上提高了缺血性腦卒中患者的神經功能恢復［1，2］。電針治療對缺血再灌注大鼠模型神經功能恢復及海馬區神經可塑性相關基因15(CPG15，candidate plasticity－related gene 15)表達會產生怎樣影響，CPG15在針刺抗腦缺血損傷中樞神經重塑過程中的作用機制是怎樣的，本實驗對此進行了探討。

1 材料

1.1 動物 健康成年SD大鼠60只，雌雄各半，體質量為220±20g，購自南京安立默實驗動物有限公司，實驗動物生產許可證號:SCXK(蘇)2009－0007號。同等條件下適應性喂養1周。按照隨機分組方法，將60只SD大鼠分為正常對照組、腦缺血再灌注模型組、電針“百會、風府”組、電針非經穴組、尼莫地平治療組，每組各12只。

1.2 藥品 水合氯醛，批號:W20091022，生產企業:中國醫藥集團上海化學試劑公司;80萬單位青霉素，批號:20100627，生產企業:哈藥集團制藥總廠;尼莫地平，批號:20100509，生產企業:上海信誼嘉華藥業有限公司;多聚甲醛，批號:091020，生產企業:中國醫藥(集團)上海化學試劑公司。

1.3 主要試劑及儀器 CPG15單克隆抗體(BS－2464R)，生產批號:909881W，購自北京博奧森生物技術有限公司;SP－9000，生產批號812257A，購自北京中杉金橋生物技術有限公司;3－二氨基聯苯胺(diam inobenzidine，DAB)顯色試劑盒，購自北京中杉金橋生物技術有限公司;一抗稀釋液，購自碧云生物技術研究所;抗原修復液，購自北京中杉金橋生物技術有限公司;L734型冷光立式四孔手術無影燈，上海醫療器械股份有限公司醫療器械五廠;PCE－A型程控電針治療儀，安徽天恒有限公司制;932型電熱燒灼器，上海醫療器械八廠;TB－718自動包埋機，泰維電子設備有限公司;LEICA RM2135自動切片機，LEICA公司;TK2218I恒溫攤片烤片機，泰維電子設備有限公司;OLYMPUS VANOX顯微鏡，日本OLYMPUS光學工業株式會社;LEICA ASP200自動脫水機，LEICA公司;南京捷達JD2801形態學顯微圖像分析系統，南京捷達科技發展有限公司。

1.4 實驗條件 動物于安靜的環境下分籠飼養，飼養室溫控制在(24±1)℃的范圍、相對濕度(55±5)%的環境中，12h明暗交替，塑料籠內以無菌木屑做墊料，食水自取。

2 方法

2.1 模型制作方法 參照Zea Longa方法［3］，使用一端涂抹硅樹脂尼龍絲，將尼龍絲插入右側頸內動脈，閉塞大腦中動脈(MCA)，阻斷MCA的血流2小時，后將尼龍絲輕輕拔出，從而復制腦缺血再灌注(BI/R)大鼠模型，模型復制成功的標志為大鼠出現右側Horner綜合征(左側瞳孔縮小)，麻醉清醒時出現左前肢或左前后肢癱瘓，線栓拔出后頸內動脈、Willis環無血栓及出血為標準。術后傷口部碘伏消毒，術后3天連續腹腔注射青霉素鈉(8萬U/d)預防感染。

2.2 神經功能缺損評分 采用Longa 5分法標準［3］，在大鼠腦缺血2h再灌注動物蘇醒時和治療2周后進行神經功能缺損評分:0分，無神經損傷癥狀;1分，不能伸展對側前爪;2分，向外側劃圈;3分，向對側傾倒;4分，不能自發行走，意識喪失。

2.3 治療方法 電針經穴組選擇“百會”、“風府”穴，具體定位:“百會”穴位于大鼠頂骨與頂間骨之間凹陷處;“風府”穴位于枕骨下方正中凹陷處。針刺方法:穴位處常規消毒后，以30號1寸毫針斜刺入“百會”穴、“風府”穴約0.5寸，將針柄分別連接至電針儀上，“百會”穴接陰極，“風府”穴接陽極，電針頻率2Hz，疏波，強度以大鼠安靜耐受為度，一般3～5mA，時間30min，每天1次，均在上午10點左右進行，連續治療2周。電針非經穴組統一選擇右臀部非經非穴位置針刺，接電針刺激，刺激參數同電針經穴組。西藥治療組以尼莫地平混懸液，按20mg/kg·d量灌胃，每日2次(上午8點，下午4點)，連續灌胃治療2周。

2.4 標本取材 于造模后2周各個相應的時間位點以10%水合氯醛麻醉(3.6mL/kg)大鼠，打開胸腔，于右心耳部剪一小口，從左心室插入導管至主動脈，向內快速注入37℃肝素化生理鹽水250mL，至右心耳流出液變清亮，然后注入4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液250mL，灌流固定30min后斷頭取腦，除去小腦和腦干，取大腦，放入4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液中固定1d，脫水、透明、浸蠟，在視交叉前后連續制作腦部冠狀切片。

2.5 指標檢測 SP染色:Ⅰ抗CPG15稀釋濃度為1∶100，陰性對照組采用正常山羊血清替代Ⅰ抗進行，DAB2H2O2顯色液顯色，蘇木精輕度復染。

2.6 數據處理與統計學處理 根據大鼠腦缺血半暗帶的定位方法，相近部位同倍10×40，7個不同視野，采用南京捷達JD－801圖像分析系統，統計海馬區CPG15陽性細胞總面積單位和平均光密度值。所得數據經SPSS13.0統計軟件進行數據分析。統計數據用均數±標準差表示，各組間均數比較采用單因素方差分析，組間均數的兩兩比較采用LSD法，以P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 神經功能缺損評分對比 見表1。由表1可以看出模型組大鼠神經功能缺損顯著差于正常對照組，P＜0.01。電針經穴組與西藥治療組大鼠神經功能評分差異不顯著，P＞0.05;而較模型組兩者均有顯著性差異，P＜0.01;較正常對照組有一定差異性，P＜0.05。電針非經穴組大鼠神經功能缺損評分與模型組比較差異不明顯，P＞0.05，且顯著弱于電針經穴組和西藥對照組，P＜0.01。

表1 各組實驗大鼠神經功能缺損評分治療前后對比(分)

表1 各組實驗大鼠神經功能缺損評分治療前后對比(分)

注:與正常對照組比較，▲▲P＜0.01，▲P＜0.05;與腦缺血再灌注模型組比較，＊＊P＜0.01，*P＜0.05;與電針“百會、風府”組比較，##P＜0.01，#P＜0.05;與電針非經穴組比較，★★P＜0.01，★P＜0.05;與尼莫地平治療組比較，◆◆P＜0.01，◆P ＜0.05。

周后正常對照組 12 0 0＊＊#★★◆組別 數量(只) 治療前 2模型組 12 2.796 ±0.186 2.524 ±0.482▲▲##◆◆電針經穴組 12 2.652 ±0.224 0.794 ±0.156▲＊＊★★電針非經穴組 12 2.787 ±0.253 1.986 ±0.269▲▲##◆◆西藥治療組 12 2.543 ±0.149 0.788 ±0.346▲＊＊★★

3.2 光鏡下觀察結果 光鏡下，正常組只見極少量棕褐色的CPG15陽性細胞表達，而BI/R模型組、電針經穴組、電針非經穴組、藥物治療組腦中均可見不同程度的棕褐色的CPG15陽性細胞，以海馬區陽性細胞密度增加為顯著。呈卵圓形或圓形，陽性細胞胞漿染色較深，多為星形膠質細胞。以正常羊血清代替CPG15一抗孵育對照組的切片，結果為陰性，見圖1。從各組照片可以看出正常組大鼠海馬區CPG15陽性細胞胞漿染色極淺，量少，而其余四組大鼠海馬區CPG15陽性細胞胞漿染色明顯變深，量多，其中以電針經穴組與西藥治療組CPG15陽性細胞胞漿染色最為顯著，而電針非經穴組大鼠海馬區CPG15陽性細胞胞漿染色相對較淺，與模型組差異不明顯。

圖1 免疫組化方法檢測各組大鼠缺血再灌注海馬區CPG15蛋白表達情況

3.3 免疫組織化學方法檢測海馬組織CPG15 見表2。由表2可以看出正常組CPG15陽性細胞表達不顯著，平均光密度值低，較其他各組均有顯著性差異，P＜0.01;其他各組CPG15陽性細胞表達及平均光密度值均有提高，且電針經穴組與尼莫地平組表達最明顯，此兩組之間比較差異性不顯著，P＞0.05，但較模型組和電針非經穴組有顯著性差異，P＜0.01，而模型組與電針非經穴組CPG15陽性細胞表達及平均光密度值比較，差異性不大，P＞0.05。說明電針和西藥尼莫地平對于增強CPG15的表達起到明顯促進作用。

表2 各組缺血2h再灌注CPG15表達陽性細胞單位面積和平均光密度值治療后對比

4 討論

CPG15是以色列科學家Nedivi等于1993年通過構建谷氨酸類似物海人藻酸(KA，kainic acid)激活型大鼠海馬齒狀回 cDNA文庫得到的一個基因［4］。1996年，Nedivi［5］從KA激活型大鼠海馬齒狀回cDNA文庫和人類皮質cDNA文庫篩選、鑒定得到CPG15，并進行了初步的功能研究發現CPG15能促進神經突起的快速生長，故又將其命名為Neuritin。CPG15是一個在神經系統高度表達的基因［6］，在神經系統發育過程中主要在海馬、嗅球中表達;而在成年后，表達限制在那些發生結構改變并與神經活動密切相關的組織［7］。CPG15蛋白能促進神經突起的生長及其分支和突觸的發育成熟，調節突觸回路的形成;其表達主要局限于神經系統以及神經可塑性相關的區域，且神經活動和神經營養素(neurotrophines，NTs)均能誘導其表達，提示CPG15可能與神經活動及NTs促進神經突起生長的作用有關［8］。這些特點使CPG15成為神經系統的發育成熟及創傷修復中重要候選因子。CPG15在促進突觸成熟、防止神經細胞凋亡、保護神經元等方面有重要作用［9］。并且介導神經生長因子(NGF)促進成人感覺神經元軸突的生長［10］。

神經細胞之間通過特異的通訊結構——“突觸”形成功能性神經環路來傳遞和存儲信息。突觸在神經細胞持續活動影響下可發生特異性的結構和功能變化，這稱之為“突觸可塑性”。它在神經系統發育和學習記憶中起著至關重要的作用。電針治療腦梗塞的生物學基礎是通過多種機制影響神經元可塑性，目前關于針灸對腦神經可塑性研究已見部分報道，盧圣鋒等［11］以SAMP8小鼠作為老年癡呆(AD)動物模型，電針“百會”、“涌泉”穴，發現電針能有效調整海馬神經元突觸形態，使突觸后致密物增厚，突觸間隙寬度變窄，促進突觸形態可塑性的發揮。徐虹等［12］觀察到，電針能夠抑制損傷相關的血管內皮細胞信號表達，促進修復相關的神經元和神經膠質細胞表達，認為針刺可能通過上調損傷－修復網絡功能，促進梗死區神經功能的恢復。高劍鋒等［13］研究發現局灶腦缺血再灌注可激活老齡大鼠海馬角回(dentate gyrus，DG)區域的神經干細胞發生增殖、遷移，針刺穴位能使局灶腦缺血再灌注后海馬DG區域的神經干細胞發生明顯增殖，有效提高神經干細胞的神經元分化，合理調控膠質細胞反應，從而發揮拮抗腦缺血再灌注損傷作用。趙丹等［14］研究多巴胺D1、D2受體在腦缺血后神經可塑性中的作用及電針的影響，發現電針可以對腦缺血后多巴胺D1、D2受體的數量和功能進行調節，減輕其損害作用，促進其達到平衡狀態，從而對神經功能進行保護和修復。

我們的實驗結果提示針刺對促進大鼠缺血再灌注損傷區CPG15陽性細胞含量的表達起到顯著促進作用，同時神經功能得到明顯改善，說明針刺對腦神經可塑性具有促進意義。據此我們認為針灸治療腦梗塞，促進腦神經可塑性的機制可能是通過上調CPG15而發揮作用。CPG15基因參與了腦缺血損傷后神經再生的調控。

百會、風府均為督脈經穴，督脈又歸屬于腦。此外，根據《靈樞·衛氣》中“氣街”理論，“頭氣有街”、“氣在頭者，止之于腦”，即經氣到頭部的都聯系于腦。又根據“四海”理論，“腦為髓海”，楊上善注說“胃流津液滲入骨空，變而為髓，頭中最多，故為海也，是腎所生，其氣上輸腦蓋百會穴，下輸風府也”。可見，百會穴、風府穴與腦密切聯系，是調節大腦功能的要穴。針刺百會、風府穴，具有醒腦開竅、健腦補髓、疏風通絡的功效，因此選取此二穴作為電針治療腦缺血再灌注損傷模型的處理穴位。本次實驗證實了針刺“百會”、“風府”可以促進大鼠受損神經功能恢復，能提高大鼠海馬區CPG15表達，說明電針對腦缺血再灌注后腦細胞的神經可塑性有促進作用。這為臨床針灸治療腦梗塞提供了理論依據。

［1］楊福霞，楊卓欣，于海波，等.調任通督針法治療腦梗塞恢復期患者的臨床觀察［J］.針灸臨床雜志，2011，27(4):47 －48.

［2］倪麗偉，申鵬飛，張智龍，等.“醒腦開竅”與非經非穴針刺對腦梗塞急性期神經功能影響的多中心隨機對照研究［J］.中華中醫藥雜志，2011，26(5):894 －897.

［3］Zea Longa E L，Weinstein P R，Carlson S，et a1.Re－versible middle cerebral artery:occlusion without raniectomy in rats［J］.Stroke，1989，(20):84－91.

［4］NediviE，HevroniD，Naot D，et al.Numerous candidate plasticity － related gense revealed by differential cDNA cloning［J］.Nature，1993，363(6431):718－722.

［5］Nedivi E，Fiedust S，Theill LE，et al.A set of genes expressed inresponse to light in the adult cerebral cortex and regulated duringdevelopment［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1996，93(5):2048 －2053.

［6］黃 瑾，楊 磊，應 康，等.人類 Neuritin cDNA的克隆與表達［J］.復旦大學學報(自然科學版)，2001，40:521－524.

［7］Yamagata K，Sugiura H，SuzukiK.Structure and function of neuralplasticity－related gene products［J］.Neurobid learn Mem，1998，7037 －43.

［8］Putz U，Harwell C，Nedivi E.Soluble CPG15 expressed during earlydevelopment rescues cortical progenitors from apoptosis［J］.Nat Neurosci，2005，8(3)322 －331.

［9］Fujino T，Wu Z，Lin WC，etal.Cpg15 and cpg15 －2 constitute a family ofactivity－regulated ligands expressed differentially in the nervous system to promote neurite growth and neuronal surviva.Comp Neuro［J］.2008，507(5):1831－1845.

［10］Karamoysoyli E，Burnand RC，Tomlinson DR，etal.Neuritin Mediates Nerve Growth Factor－Induced AxonalRegeneration and IsDeficient in Experimental Diabetic Neuropathy［J］.Diabetes，2008，57(1):181 －189.

［11］盧圣鋒，邵 欣，唐 勇，等.電針促進阿爾茨海默病模型小鼠(SAMP8)海馬神經元突觸可塑性的神經細胞黏附機制［J］.中國康復醫學雜志，2008，23(12):1057 －1060.

［12］徐 虹，洪禮傳，黃艷秋，等.針刺對腦缺血再灌注模型大鼠腦組織基質金屬蛋白酶、細胞間黏附分子表達的影響［J］.基礎醫學與臨床，2010，30(7):37 －42.

［13］高劍峰，呂風華，朱長連，等.電針干預對老齡大鼠腦缺血再灌注海馬內源性神經干細胞增殖分化的影響［J］.中華中醫藥雜志，2010，25(7):1075－1079.

［14］趙 丹，雷 慧，葛林寶，等.多巴胺D1、D2受體在腦缺血后神經可塑性中的作用及電針的影響［J］.山東醫藥，2010，50(80):109－110.