細菌鞭毛素對植物免疫防衛反應及其信號機制的激發

武曉麗, 陳華民, 吳茂森, 何晨陽

(中國農業科學院植物保護研究所,植物病蟲害生物學國家重點實驗室,北京 100193)

研究表明,對植物接種致病菌或病原菌產物可以使植物獲得相關病害的免疫特性,植物對病原物侵染的忍耐、抵抗和適應性是在兩者共同進化過程中逐漸產生和形成的。由于植物體不具備類似動物的免疫系統,寄主植物常依賴自身的先天免疫(innate immunity)系統來抵御病原物的侵染[1]。植物先天免疫系統通過探測病原物相關分子模式(pathogen-associated molecular pattern,PAMP)而被激活,使植物表現抗性[2]。PAMP是進化上保守的,來源于病原物而非植物本身的分子,如病原物鞭毛素、脂多糖、葡聚糖和幾丁質分子,都可以激發植物的防衛反應。目前研究較多的是細菌鞭毛素和EF-Tu、卵菌七葡聚糖、真菌木聚糖酶[3-6]。由于非病原物也可以產生這類分子,所以又提出了MAMP(microbe-associated Molecular pattern)的概念;凡是進化保守的,來源于微生物可激發寄主植物防衛反應的分子稱為MAMP[7]。

與動物的免疫機制不同,植物依靠每個細胞的先天免疫性和病原物侵染位點產生的系統信號來抵御病原物的入侵。目前認為植物被誘導的抗病性主要包括兩部分[8]：第1部分是植物依靠分子模式識別受體(pattern recognition receptor,PRR)識別進化上保守的PAMP,從而激發植物的PTI(PAMP-triggered immunity)反應。PTI反應可抑制病原菌侵染植物體,同時病原菌也進化出了抵抗植物PTI的機制,病原菌通過干擾PRR與PAMP的識別,或將效應蛋白注入植物體來抑制PT I反應;同時,植物也形成了更加特異的識別機制,從而引發了第2部分抗性：ETI(effector-triggered immunity)反應,ETI反應也被認為是一種擴大了的PTI反應,稱為過敏反應(hypersensitive response,HR),這種反應通常是為了抑制病原菌的侵入而形成的一種程序化細胞死亡[9]。PTI和ET I均是重要的植物抗性反應,PTI抗性可以抑制大范圍的病原菌感染[10],ETI抗性則能在植物體內形成過敏反應,可造成侵染位點細胞的迅速死亡,這種抗性即稱為基因對基因抗性(gene-for-gene resistance)。但ETI反應通常只局限于某個植物種類的某些成員,而非所有成員,這種抗性是不持久的,因為病原菌會生成新的效應蛋白來維持對植物的致病性[11]。

鞭毛是細菌的主要運動器官,同時也是一種重要的致病因子。鞭毛素(flagellin)是組成鞭毛絲的亞基,可形成纖絲結構,鞭毛素可作為PAMP因子被寄主識別,從而誘發植株一系列防衛反應。本文將結合本實驗室水稻白葉枯病菌相關的研究進展,綜述近年來鞭毛素激發植物免疫反應方面的最新研究成果。

1 鞭毛素的識別位點

1.1 鞭毛素flg22誘導植物細胞防衛反應

丁香假單胞菌煙草變種菌體粗提物經煮沸滅活后,可刺激煙草懸浮細胞產生堿化反應;經分離純化、測序后,發現粗提物中的有效成分是鞭毛素[12]。自此,鞭毛素作為一種可引發植物細胞防衛反應的PAMP因子開始為人們所熟知。進一步的研究發現,多種病原菌鞭毛素的 N端呈現高度保守性。flg22是人工合成的鞭毛素N端22個氨基酸肽段,具有比鞭毛素更強的活性,能夠激發植物細胞各種防衛反應。因此,flg22被認為是鞭毛素的活性位點,是激發植物細胞抗性反應的關鍵區段。動物細胞識別鞭毛素的位點不同于植物細胞,引起哺乳動物炎癥反應的病原菌鞭毛素保守的N-末端及C-末端均與植物病原菌鞭毛素存在較大差異,而且動物細胞識別的鞭毛素保守位點對于細菌的運動性發揮著更為重要的作用[13]。

盡管細菌flg22區段是高度保守的,但個別氨基酸殘基是可變的。根癌土壤桿菌和青枯病菌鞭毛素flg22區段某些氨基酸殘基變異后,不能誘導植物細胞的防衛反應[12,14]。甘藍黑腐病菌鞭毛素flg22的第43位氨基酸殘基是誘導擬南芥防衛反應的關鍵位點;當該位點的天冬氨酸殘基發生變異后,鞭毛素就會失去誘導擬南芥防衛反應的能力[15]。

1.2 鞭毛素flg22以外區域誘導植物細胞防衛反應

在植物-病原菌互作過程中,鞭毛素flg22外區域也具有誘導植物防衛反應的能力。可侵染水稻、燕麥、玉米等植物的廣寄主病原菌燕麥食酸菌水稻親和菌株、鞭毛素及flg22區段均不能誘導水稻細胞防衛反應,而燕麥食酸菌水稻非親和菌株及鞭毛素則可誘導水稻細胞防衛反應,但非親和菌株鞭毛素的flg22區段卻不能誘導水稻細胞防衛反應,說明鞭毛素誘導水稻防衛反應的機制與flg22誘導擬南芥等十字花科植物是不同的[16-17]。在這兩種機制中,鞭毛素以及flg22區段以外的氨基酸序列所發揮的作用還是未知的。

丁香假單胞菌煙草變種鞭毛素粗提物不能激發水稻細胞的防衛反應[12]。本室研究表明,親和的水稻白葉枯病菌以及不親和的番茄斑點病菌鞭毛素氨基酸序列同源性高達98.72%,均不能激發水稻細胞的防衛反應;兩者與可引發水稻防衛反應的燕麥食酸菌菌株的鞭毛素同源性較低,分別為62.35%和52.54%(本室資料)。表明鞭毛素引發水稻等單子葉植物防衛機制以及鞭毛素作用位點有待深入研究。

2 鞭毛素flg22的受體

2.1 flg22的受體FLS2

動物細胞引發原初免疫反應最重要的PRR類受體蛋白是TLR(toll-like receptor)。TLR是一類位于細胞膜、富含亮氨酸重復單元(leucine-rich repeat,LRR)的受體蛋白。迄今已鑒定出11種TLR受體蛋白,其中TLR5被認為是鞭毛素受體[13]。通過篩選對鞭毛素不敏感的擬南芥突變體,發現了植物細胞中的鞭毛素受體FLS2[18]。FLS2編碼的是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,是一類富含亮氨酸重復序列(LRR)的跨膜受體類激酶(receptor-like kinase,RLK)。FLS2與TLR5的結構具有一定的相似性,均含有一個胞外 LRR結構域,但 TLR5具有胞內TIR區域,而FLS2卻沒有,而且兩者與鞭毛素的結合位點及下游反應組分也不同[19]。

近年來,已通過化學交聯和免疫沉淀的方法證實FLS2與flg22之間的互作[5]。FLS2識別flg22后可誘發植物細胞內一系列的防衛反應[20],FLS2的磷酸化對鞭毛素flg22的識別以及下游信號的產生是必需的,缺失FLS2的擬南芥突變體植株對病原細菌更加敏感[21]。

2.2 FLS2的細胞內吞作用

當位于質膜的FLS2識別flg22后,細胞就會發生內吞作用,將Fls2-flg22復合體轉移至細胞囊泡之中[22]。激酶抑制劑K 252a能夠抑制FLS2發生內吞作用,這說明FLS2的磷酸化在內吞作用中發揮重要作用。將FLS2的3個蘇氨酸殘基突變為丙氨酸后發現,FLS2雖然還能夠與flg22結合,但卻不能發生內吞作用[23]。內吞作用對flg22信號的傳遞具有重要作用,flg22誘導的經渥曼青霉素預處理的擬南芥細胞培養基中MAP激酶活性顯著降低,但活性氧猝發卻沒有受到影響,說明FLS2細胞內吞作用在flg22誘導植物細胞早期防衛反應中可能不發揮作用,但在信號傳遞過程中是必需的[24]。

3 flg22誘導的防衛反應

3.1 flg22誘導的早期防衛反應

flg22可誘導植物細胞多種防衛反應,其中早期的反應包括：離子流的產生(表現為細胞培養基堿化),活性氧(ROS)的猝發,一氧化氮(NO)的產生,以及胼胝質沉積等多種反應。

介質堿化是包括flg22在內的激發子處理植物細胞發生的最早期事件之一,已經廣泛作為研究激發子誘導植物細胞防衛反應的指標[12,25-26]。早前的研究多認為胞外堿化是活性氧引起脂膜過氧化,造成膜結構改變進而引起電解質滲漏造成的[27],目前已基本確定胞外堿化是細胞發生的積極生理反應,由鉀離子和氫離子的交換引起的;同時鈣離子和氯離子也可能參與了反應[28]。

ROS猝發是植物細胞受到病原物及flg22等激發子的刺激最早出現的標志性反應之一[12,29]。研究表明,植物受到病原物侵染數分鐘或數小時內,在葉綠體和線粒體質子運轉過程中和過氧化物體的光氧化脅迫中產生大量活性氧[30]。此外,鈣離子的濃度對植物細胞ROS的激活是至關重要的[31]。

NO是一種廣泛分布于生物體內的氣體活性分子,同時也是細胞內及細胞間的重要信號分子,具有多種生理功能,因在動物細胞中發揮的重要作用得到了廣泛關注,而后NO在植物細胞中的作用也陸續被人們揭示。NO是植物防衛反應的重要信號分子,促進了過敏性壞死反應的產生和抗病反應的激活。在轉錄水平上,NO能夠調節多個防衛基因的表達,包括編碼PR蛋白和次級代謝的相關蛋白[32]。在flg22處理的擬南芥細胞內可檢測到NO信號分子的存在[33]。

植物細胞壁的乳突是由于胼胝質、富含脯氨酸的糖蛋白和其他物質在細胞壁上沉積所形成的結構[34],乳突的形成增加了細胞壁的厚度,而胼胝質沉積則可使細胞壁進一步增厚,進而增強植物細胞抵御病原菌入侵的能力。經flg22處理的擬南芥幼苗24 h后,在子葉和莖部組織都發現了胼胝質沉積現象[35],說明flg22可誘導植物細胞的抗病反應。

3.2 flg22誘導的MAPK級聯反應

flg22被FLS2識別,誘導了植物細胞一系列的早期防衛反應后,會進一步激活MAPK(mitogenactivated protein kinase)級聯反應,誘導防衛基因的表達。MAPK級聯反應通常涉及3種功能連鎖的蛋白激酶,分別是MAPK激酶激酶(MAPKKK)、MAPK激酶(MAPKK)以及MAPK。這3種激酶按照MAPKKK-MAPKK-MAPK的順序依次被磷酸化激活,一旦MAPK被激活,就可以磷酸化下游的特異蛋白,進而引發細胞內反應[36]。

用flg22處理擬南芥原生質體后,激發的MAPK級聯反應激酶主要由MAPK激酶激酶MEKK 1,MAPK激酶MKK 4/5和MAP激酶MPK 3/6構成,在這個MAPK級聯反應中,具有活性的MEKK 1特異的依次激活了 MKK 4/5和MPK 3/6,最終導致位于FLS2下游的特異性轉錄因子WRKY 22/WRKY 29被磷酸化[37]。flg22除可激發MPK3/6外,還可誘導MPK 4的活性,故擬南芥中很可能還存在著MEKK1-MKK 1/2-MPK 4這樣一個平行于MEKK 1-MKK 4/5-MPK 3/6的MAPK級聯反應途徑[38]。雖然這些研究結果目前尚未有統一的定論,flg22激發的MAPK級聯反應通路也沒有得到最終的確認,但以上結論均證實鞭毛素flg22區段可有效地誘導植物細胞發生MAPK級聯反應。

3.3 BAK 1介導的flg22信號傳導

BAK 1是一個具亮氨酸重復的RLK(receptorlike kinase),涉及了FLS2的信號傳導[39]。在bak1擬南芥突變體中,FLS2與flg22表現正常的結合能力,但flg22誘發的早期和后期防衛反應卻明顯降低,表現為 AOS的產生大大降低,MAPK 3和MAPK 6的激活也受到了抑制,說明BAK 1可能正調控了flg22所引起的防衛反應。其調控機制可能為BAK 1可以在植物細胞感受flg22刺激后,迅速地結合在FLS2-flg22的復合體中,形成 BAK 1-FLS2-flg22復合體,進而促進了flg22誘導的下游防衛反應的發生[39-40]。

3.4 flg22誘導防衛基因的表達

除可激發植物細胞MAPK級聯反應外,大量的試驗證據表明flg22還可誘發一系列防衛基因的表達,如早期基因 WRKY22/29、FRK1等;晚期基因PR1/5等[37]。經 flg22處理的擬南芥細胞中,約1 000個基因上調表達,約200個基因下調表達,其中RLKs、WRKY轉錄因子及一些受體蛋白基因的上調表達,表明植物細胞已經引發了對病原菌入侵的原初防衛反應,而一些與植物激素代謝有關的基因發生下調表達則表明細胞的分化及生長可能會被抑制[41]。

4 結束語

對于PAMP所激發的植物細胞防衛反應及信號傳導通路的研究一直是分子植物病理學所關注的問題之一,隨著大量研究成果的涌現,為植物-病原菌互作機理的深入揭示提供了可靠的依據。鞭毛素flg22作為研究最為深入的PAMP分子之一,為探索植物免疫反應機制提供了諸多有價值的理論依據,特別是flg22受體FLS2可發生細胞內吞作用,是植物中首次發現的PAMP受體細胞內吞現象。這種類似的現象在動物細胞中也有發現,這說明受體蛋白的細胞內吞作用可能是在動植物細胞中普遍存在的一種現象,而其在動植物免疫反應及獲得抗性的過程中發揮的作用還不清楚,相信隨著研究的不斷深入,其機制會得到進一步闡明。

對于flg22激發植物免疫反應的信號傳導途徑目前還沒有明確的結論。研究表明,該通路與多種植物激素介導的防衛反應信號通路相關聯;此外,鞭毛素誘導水稻等單子葉植物防衛反應的機理研究還不是很深入,對于鞭毛素與單子葉植物互作的活性位點以及在細胞中的受體的研究都將成為今后的重點。

[1]Nu rnberger T,Brunner F,Kemmerling B,et al.Innate immunity in plants and animals：striking siMilarities and obvious differences[J].Immun Rev,2004,198：249-266.

[2]Underw ood W,Zhang S,H e S Y.The Pseudomonassyringae typeⅢeffector ty rosine phosphatase HopAO1 suppresses innate immunity in Arabidopsis tha liana[J].Plant J,2007,54(4)：658-672.

[3]Maruyama N,Mohamed Salleh MR,Takahashi K,et al.Stru cture-phy sicocheMical function relationshipsof soybean beta-cong lycinin heterotrimers[J].JAg ric Food Chem,2002,50：4323-4326.

[4]Ron M,Avni A.The receptor for the fungal elicitor ethyleneindu cing xylanase is a member of a resistance-like gene faMily in tomato[J].Plant Cell,2004,16：1604-1615.

[5]Chinchilla D,Bauer Z,Regenass M,et al.The Arabidop sis receptor kinase FLS2 binds flg22 and deterMines the specificity of flagellin perception[J].Plan t Cell,2006,18：465-476.

[6]Zipfel C,Kunze G,Chinchilla D,et al.Percep tion of the bacterial PAMP EF-Tu by the receptor EFR restrictsagrobacterium-mediated transformation[J].Cell,2006,125：749-760.

[7]Akira S,Takeda K.Toll-like receptorsignaling[J].Nat Rev Immunol,2004,4：499-511.

[8]Jones JD,Dang J L.The plant immune system[J].Natu re,2006,444：323-329.

[9]Bittel P,Robatzek S.Microbe-associated molecular patterns(MAMPs)probe plant immunity[J].Cu rr Opin Plant Biol,2007,10：335-341.

[10]Thordal-Christensen H.Fresh insights into processes of nonhost resistance[J].Cu rr Opin Plant Biol,2003,6：351-357.

[11]Dang J L,Jones JD.Plant pathogens and integrated defense responses to infection[J].Nature,2001,411：826-833.

[12]Felix G,Duran J D,Volko S,et al.Plants have a sensitive perception sy steMfo r the most conserved doMain of bacterial flagellin[J].Plan t J,1999,18：265-276.

[13]Smith K D,Andersen-Nissen E,Hayashi F,et al.Toll-like receptor 5 recognizes a conserved site on the flagellin required for protofilament formation and bacterialMotility[J].Nat Immunol,2003,4：1247-1253.

[14]Pu fund C,Tans-Kersten J,Dunning F M,et al.Flagellin is not amajor defense elicito r in Ra lstonia so lanacearuMcells or extracts applied to A rabidopsis tha liana[J].Mol Plan t Microbe,2004,17：696-706.

[15]SunW X,Dunning FM,Pfund C,et al.Within-species flagellin polyMorphisMin Xanthomonas campestris pv.campestris and its impact on elicitation of Arabidop sis flagellin sensing2-dependent defenses[J].The Plant Cell,2006,18：764-779.

[16]Che F S,Nakajima Y,Tanaka N,et al.Flagellin froman incoMpatible strain of Pseudomonasavenae induces a resistan ce response in cultu red rice cells[J].JBiolChem,2000,275(41)：32347-32356.

[17]Tanaka N,Che F S,Watanabe N,et al.Flagellin froman incoMpatible strain of Acidovorax avenae mediates H2O2generation accompanying hy persensitive cell death and expression of PA L,Cht-1,and PBZ1,but not of LOX in rice[J].Mol Plan t Microbe,2003,16(5)：422-428.

[18]Gomez-Gomez L,Boller T.FLS2：an LRR receptor-like kinase involved in the perception of the bacterial elicitor flagellin in Arabidop sis[J].Mol Cell,2000,5：1003-1011.

[19]Ausubel F M.A re innate immune signaling pathw ays in plants and animals conserved?[J].Nat Immun,2005,6：973-979.

[20]Bauer Z,Gomez-GoMez L,Boller T,et al.Sensitivity of different ecoty pes and mu tants of Arabidop sis tha liana tow ard the bacterialelicitor flagellin correlates with the presence of receptor-binging sites[J].JBiol Chem,2001,276：45669-45676.

[21]Gomez-Gomez L,Bauer Z,Boller T.Both the ex tracellular leucine-rich repeat doMain and the kinase activity of FLS2 are required for flagellin binding and signalling in Arabidop sis[J].Plant Cell,2001,13：1155-1163.

[22]Robatzek S.Vesicle trafficking in plant imMune responses[J].Cell Microbiol,2007,9(1)：1-8.

[23]Robatzek S,Chinchilla D,Boller T.Ligand-indu ced endocy tosisof the pattern recognition recepto r FLS2 in Arabidop sis[J].Genes Dev,2006,20：537-542.

[24]Chinchilla D,Boller T,Robatzek S.Flagellinsignalling in plan t immunity[J].Adv Exp Med Biol,2007,598：358-371.

[25]Felix G,Regenass M,Boller T.Specific perception of subnanomolar concentrationsof chitin fragements by tomato cells：induction of ex tracellu lar alkalinization,changes in protein phosphorylation,and establishment of a refracto ry state[J].Plant J,1993,4：307-316.

[26]Schaller A,Oecking C.Modulation of plasmamembrane H+-A TPase activity differentially activates wound and pathogen defense responses in tomato plants[J].Plant Cell,1999,11(2)：263-272.

[27]Keller B U,Hedrich R,Raschke K.Voltage-dependent anion channels in the plasma membrane of guard cells[J].Natu re,1989,341：450-453.

[28]Boller T.CheMoperception of microbial signals in plan t cells[J].Annu Rev Plan t Physiol Plant Mol Biol,1995,46：189-214.

[29]Lamb C,Dixon R A.The oxidative burst in p lan t disease resistance[J].Annu Rev Plant Phy siol Plant Mol Biol,1997,48：251-275.

[30]Desikan R,Mackerness S A,H an cock J T,et al.Regu lation of the Arabidop sis transcriptome by oxidative stress[J].Plan t Physiology,2001,127：159-172.

[31]W hite P J,Broadley MR.CalciuMin plants[J].Annals of Botany,2003,92：487-511.

[32]ParaniM,Rudrabhatla S,Myers R,et al.Microarray analysis of nitric oxide responsive transcrip ts in A rabidopsis[J].Plan t Bio J,2004,2：359-366.

[33]Zeidler D,Zahringer U,Gerber I,et al.Innate immunity in Arabidopsis thaliana：lipopolysaccharides activate nitric oxide synthase(NOS)and induce defense genes[J].Proc Natl Acad Sci USA,2004,101：15811-15816.

[34]Bestwick C S,Bennett MH,Mansfield JW.H rp mutant of Pseudomonas syringae pv.phaseolicola induces cell wall alterationsbut not meMbrane damage leading to the hypersensitive reaction in lettu ce[J].Plant Phy siol,1995,108：503-516.

[35]Gomez-Gomez L,Felix G,Boller T.A single locusdetermines sensitivity to bacterial flagellin in Arabidop sis tha liana[J].Plant J,1999,18：277-284.

[36]Pedley K F,Martin G B.Role ofmitogen-activated protein kinases in plant immunity[J].Cu rr Opin Plant Biol,2005,8：541-547.

[37]Asai T,Tena G,Plotnikova J,et al.MAP kinase signalling cascade in A rabidopsis innate immunity[J].Nature,2002,415：977-983.

[38]Meszaro T,H elfer A,H atzimasoura E,et al.The Arabidop sis MAP kinase kinase AKK 1 par ticipates in defense responses to the bacterialelicitor flagellin[J].Plant J,2006,48：485-498.

[39]Chinchilla D,Zipfel C,Robatzek S,et al.A flagellin-indu ced coMplex of the recep tor FLS2 and BAK 1 initiates plan t defense[J].Natu re,2007,488：497-500.

[40]H eese A,H ann D R,GiMenea-Ibanez S,et al.The receptorlike kinase SERK 3/BAK 1 is a cen tral regulator of innate immunity in plants[J].Proc Nati Acad Sci USA,2007,104：12217-12222.

[41]Zipfel C,Robatzek S,Navarro L,et al.Bacterial disease resistance in A rabidopsis th rough flagellin perception[J].Nature,2004,428：764-767.