廢舊免疫組化液體石蠟筆的再利用技術

鄭燕璇 王曉鴻

免疫組織化學技術是利用免疫學抗體與抗原結合的原理以及細胞化學技術對組織、細胞特定抗原或抗體進行定位定量研究的技術。它廣泛應用于生物學、組織解剖學、病理學等[1]。做免疫組化不外乎兩種方法:漂片法或貼片法[2]。然而，前者容易爛片，不適合做腦片等大而易碎的組織;后者方法較好，但為了保持良好的染色效果和節省抗體，常常需要免疫組化筆。免疫組化筆無論是國產還是進口，都有在使用過程中液體石蠟流出不暢或使用中用力過大導致液體石蠟流出過多污染片子，免疫組化液體石蠟筆使用到后期隔水性差，同時圈片數量有限，且價格昂貴。我們通過多次實驗，摸索出一種廢舊免疫組化液體石蠟筆的再利用技術，其防水性好、價格低廉、可保證免疫組化效果。

1 資料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗用品和器械 樹膠2 ml(中國上海懿洋儀器有限公司)、廢舊免疫組化液體石蠟筆一支、30張貼有腦片的載玻片(每張載玻片2張腦片)、0.05 m的PBS、各種抗體、MaxVisionTM試劑盒、DAB顯色劑(AEC顯色劑)(購于邁新試劑)、濕盒、恒溫細胞培養箱、冰箱、普通顯微鏡等。

1.1.2 實驗分組 實驗分3組:甲組用美國進口免疫組化筆畫圈;乙組用國產一般免疫組化筆(福州邁新公司生產)畫圈;丙組用廢舊免疫組化液體石蠟筆畫圈。每組15張載玻片(30張腦片)。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化筆的制作方法 將廢舊免疫組化液體石蠟筆放入二甲苯中，將筆芯中殘留的液體石蠟徹底溶解去除干凈之后取出，這樣就制成了一只再利用免疫組化筆。

1.2.2 免疫組化筆的使用方法 用小瓶倒入2 ml樹膠，加入適量二甲苯稀釋樹膠，將再利用免疫組化筆蘸少量稀釋后樹膠圍繞切片組織周圍0.2 cm處畫圈，樹膠不能覆蓋切片上的組織。

1.2.3 免疫組化MaxVisionTM法(試劑盒及抗體均購于福州邁新試劑公司)[3]。①石蠟切片脫蠟和水化后，用 PBS(pH7.4)沖洗3次，3 min次。②根據每一種抗體的要求，對組織抗原進行相應的修復。③如果有必要(內源性過氧化物酶含量過高的組織)，每張切片加一滴或50 μl 3%過氧化氫，室溫下孵育10 min，以阻斷內源性過氧化物酶的活性。PBS沖洗3次，3 min/次。④除去PBS液，每張切片加一滴或50 μl的第一抗體(用戶自選)，室溫下孵育60 min或4℃過夜，建議參見每種抗體的說明書。PBS沖洗3次，3 min/次。⑤除去PBS液，每張切片加一滴或50 μl即用型MaxVisionTM試劑，室溫下孵育10～15 min。PBS沖洗3次，3 min/次。⑥除去PBS液，每張切片加2滴或100 μl新鮮配制的DAB或AEC溶液，顯微鏡下觀察3～5 min(DAB)或10 min(AEC)。⑦自來水沖洗，蘇木素復染，PBS或自來水沖洗返藍。如果用DAB顯色，則切片經過梯度酒精脫水干燥，(二甲苯透明)，中性樹膠封固;如果用AEC顯色，則切片不能經酒精脫水，而直接用水性封片劑封片。

1.2.4 結果觀察及統計學處理觀察整個實驗過程中再利用免疫組化筆的隔水性效果;鏡下觀察組織切片中抗原與抗體結合后抗原在免疫組化中陽性反應物的表達情況，將所得數據進行統計學處理、分析。

2 結果

2.1 3種免疫組化筆隔水率的比較 美國產免疫組化筆的隔水率為90%;國產免疫組化筆的隔水率為80%;而再利用的免疫組化筆的隔水率可達90%。

2.2 3種免疫組化筆對免疫組化試驗陽性結果的影響 鏡下大體觀察發現:用再利用的免疫組化筆畫圈的切片陽性結果良好，而用美國產免疫組化筆畫圈的切片雖有陽性結果，但片子周圍有時有污染現象。

3 討論

我們在多次免疫組化實驗中發現:市售的各種免疫組化液體石蠟筆有時會出現使用不暢，甚至根本畫不出來，有時畫片時稍用力過大，液體石蠟就會從筆芯中溢出過多污染切片，是影響免疫組化結果的因素之一，而且此筆價格昂貴，一桿國產筆價格大約在400元左右，畫圈不超過200個筆芯中的液體石蠟即用完。為此，我們通過多方探索找到了理想的替代品:中性樹膠。樹膠是一種天然樹脂，廣泛應用于生物學、醫學，作為生物切片的封藏劑，它可溶于二甲苯、苯、甲苯、二氧氯環等，不溶于水[3]。中性樹膠中加入適量二甲苯稀釋，可使樹膠易浸入筆芯中，在切片上畫圈時使之順暢，同時二甲苯揮發后樹膠畫的圈淡且薄，但卻不影響隔水效果。免疫組化組織切片染色后需用中性樹膠封片，封片用的樹膠與畫圈用的樹膠相互溶合，不會形成污染。故此，我們應用其特性再利用了廢舊的免疫組化筆，在實驗中不但節約了大量的資金，而且使用方便耐用，3 ml樹膠可畫300個圈左右，代價大約只有2元錢。最重要的是它不影響免疫組化結果，由于隔水性能好，保證了抗原抗體的充分結合，增強了免疫組化的效果，節約各種抗體及試劑盒各試劑，故可推薦使用。

[1]李成文.現代免疫化學技.上海:上海科技出版社，1992:97-100.

[2]朱長庚.神經解剖學.第4版.北京:人民衛生出版社，2002:87.

[3]杜卓民.實用組織學技術.北京:人民衛生出版社，1982:63.