自體骨髓干細(xì)胞移植治療肝硬化研究進(jìn)展

劉衛(wèi) 朱斌

肝臟是人體重要的消化器官，具有強(qiáng)大的物質(zhì)代謝、合成、生物轉(zhuǎn)化等功能。各種原因?qū)е碌慕K末期肝病患者內(nèi)科治療療效欠佳，病情常不能逆轉(zhuǎn)，病死率高。晚期肝病的治療已經(jīng)成為整個(gè)世界范圍內(nèi)的醫(yī)學(xué)難題，現(xiàn)在治療終末期肝病最有效的手段是肝移植。但肝移植費(fèi)用昂貴，加之供肝來(lái)源緊張，于是人們把更多的注意力轉(zhuǎn)到了再生醫(yī)學(xué)上，即通過(guò)干細(xì)胞移植治療，以求恢復(fù)肝臟的物質(zhì)代謝功能。經(jīng)過(guò)多年對(duì)干細(xì)胞的研究，骨髓干細(xì)胞（bone marrow stem cells，BMSCs）移植已經(jīng)在國(guó)內(nèi)外得到廣泛應(yīng)用。近年來(lái)對(duì)自體骨髓干細(xì)胞移植治療肝硬化的研究也逐漸深入。經(jīng)過(guò)動(dòng)物模型及臨床研究，已經(jīng)證實(shí)其治療的有效性，并且此方法還具有操作簡(jiǎn)單、創(chuàng)傷小、不存在排斥反應(yīng)、并發(fā)癥少、費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)。本文就自體骨髓干細(xì)胞移植治療肝硬化的研究進(jìn)展作一綜述。

一、干細(xì)胞的生物學(xué)特性

干細(xì)胞是指未經(jīng)分化的、具有自我更新能力及能分化為多種細(xì)胞系的潛能細(xì)胞，分為胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞，在成體的組織和器官中存在多種干細(xì)胞：如BMSC、肝干細(xì)胞、脂肪源性干細(xì)胞、外周血干細(xì)胞等。BMSC最早由Friedenstein等于1966年發(fā)現(xiàn)。此后，不同的研究小組對(duì)骨髓來(lái)源的并與BMSCs相似的干細(xì)胞進(jìn)行了一系列的研究，并賦予其不同的稱(chēng)謂：如骨髓間質(zhì)狀干細(xì)胞（bone marrow stromal stem cell，BMSSC）、間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSC）、成人骨髓多分化誘導(dǎo)細(xì)胞（marrow-isolated adult multipotent inducible cells，MIAMI）、成人多分化祖細(xì)胞（multipotent adult progenitor cells，MAPC）、成人間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal adult stem cells，MASCS）等[1～3]。這些研究均證實(shí)了MSCs類(lèi)細(xì)胞具備多向分化潛能。雖MSCs不能無(wú)限增殖，但在良好的培養(yǎng)環(huán)境下可擴(kuò)增許多倍后仍能保持增殖能力及具有多向分化潛能。MSCs能分化為骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、非中胚層的胰島細(xì)胞和肝細(xì)胞等[4，5]。

二、干細(xì)胞與肝臟

1999年，Petersen等[6]報(bào)道了肝細(xì)胞具有骨髓源性。骨髓干細(xì)胞分為造血干細(xì)胞（hemopoietic stem cells，HSCs）和MSCs。一些學(xué)者提出骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是最有效的肝細(xì)胞分化來(lái)源細(xì)胞[7]。BMSCs向某種細(xì)胞系分化取決于培養(yǎng)環(huán)境，尤其依賴(lài)于生長(zhǎng)因子的誘導(dǎo)。一些化學(xué)藥物亦能影響B(tài)MSCs的分化方向，如將BMSCs與地塞米松、胰島素、異丁基黃嘌呤及吲哚美辛等混合培養(yǎng)后，能向脂肪細(xì)胞分化。BMSCs向肝細(xì)胞分化亦是一個(gè)較為復(fù)雜的過(guò)程。Sarah等[8]對(duì)健康成人獲取的MSCs進(jìn)行培養(yǎng)，加入20ng/mL的EGF、10ng/mL的FGF、20ng/mL的肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）、20ng/mL的綿羊頜下黏液蛋白、地塞米松、煙酰胺及苯磺酸等物質(zhì)后，同樣能獲得成熟的肝細(xì)胞，且分化而來(lái)的肝細(xì)胞具備完整的功能。有關(guān)研究證實(shí)，在肝臟的微環(huán)境中，干細(xì)胞能夠分化為有功能的肝細(xì)胞并增殖。Petersen等[6]通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)了小鼠骨髓干細(xì)胞可以分化為肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞。Okumoto等[9]用含有細(xì)胞外基質(zhì)并加入高濃度的HGF的培養(yǎng)基培養(yǎng)小鼠BMSCs，發(fā)現(xiàn)BMSCs分化為肝細(xì)胞系并增殖，并能表達(dá)白蛋白。以上研究表明，干細(xì)胞具有分化為成熟肝細(xì)胞的潛能，在適宜的微環(huán)境中，干細(xì)胞能被誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞，并表達(dá)成熟肝細(xì)胞的特異性因子。

研究表明，骨髓干細(xì)胞不僅能通過(guò)再生肝細(xì)胞來(lái)部分恢復(fù)肝細(xì)胞代謝功能，還能分泌基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP），特別是 MMP-9，降解肝臟間質(zhì)纖維組織來(lái)改善肝臟纖維化和肝硬化[10，11]。陳國(guó)忠等[12]發(fā)現(xiàn)骨髓干細(xì)胞與肝星狀細(xì)胞共培養(yǎng)能抑制星狀細(xì)胞增值及促進(jìn)其凋亡。

三、骨髓干細(xì)胞的提取和分離

骨髓干細(xì)胞的分離是臨床治療的第一步。獲取高質(zhì)量的供體細(xì)胞是關(guān)鍵，有時(shí)甚至直接影響治療效果。

骨髓干細(xì)胞分離方法較多，常用的干細(xì)胞分離方法有：貼壁篩選法、密度梯度離心法、流式細(xì)胞儀分選法和免疫磁珠分離法等。臨床上較為常用的是Oh SH[13]及Wollert[14]等報(bào)道的密度梯度離心法。該法較為簡(jiǎn)便，實(shí)用性強(qiáng)，適合臨床使用：在層流無(wú)菌治療室內(nèi)，選患者雙側(cè)髂后上棘為采髓點(diǎn)，常規(guī)消毒鋪巾局麻后，18號(hào)骨髓穿刺針穿刺，抽取骨髓 65～95ml左右，以4000U肝素抗凝，避免污染。離心去除脂肪層，用等量DMEM培養(yǎng)液稀釋骨髓，制成細(xì)胞懸液。輕輕加到密度1.073/ml的Percoll分離液上，室溫下以1200rpm離心25min。吸取界面細(xì)胞層，用生理鹽水洗脫，1500rpm離心5min×3次。生理鹽水重懸細(xì)胞，鏡下計(jì)數(shù)。

四、治療

目前，臨床常用的有同種異體骨髓干細(xì)胞移植及自體骨髓干細(xì)胞移植，但同種異體骨髓干細(xì)胞移植面臨著缺乏供體細(xì)胞、移植細(xì)胞被排斥等問(wèn)題，而自體骨髓干細(xì)胞移植則很好地解決了這些矛盾。

骨髓干細(xì)胞肝臟移植的方法包括：經(jīng)門(mén)靜脈移植、經(jīng)股動(dòng)脈移植、脾內(nèi)移植、外周靜脈移植、肝內(nèi)移植、腹腔移植等。門(mén)靜脈移植：分為經(jīng)皮肝內(nèi)門(mén)靜脈移植和剖腹腸系膜靜脈或借助腹腔鏡門(mén)靜脈移植兩種方式。后一種方式創(chuàng)傷較大，較少應(yīng)用。經(jīng)皮肝內(nèi)門(mén)靜脈移植方法的技術(shù)成熟，且創(chuàng)傷相對(duì)較小。通過(guò)門(mén)靜脈移植BMSCs的方法符合肝臟組織學(xué)及生理學(xué)特點(diǎn)，細(xì)胞更易進(jìn)入肝竇中[15]。經(jīng)股動(dòng)脈介入移植：在X線監(jiān)視下，經(jīng)股動(dòng)脈穿刺，將分離的骨髓干細(xì)胞通過(guò)導(dǎo)管從肝動(dòng)脈緩慢注入到病肝內(nèi)，之后用10 mL生理鹽水沖洗管腔，注射速度為1 mL/min[16～18]。由于介入治療的廣泛開(kāi)展，對(duì)其技術(shù)掌握也很熟練，此方法在骨髓干細(xì)胞移植中應(yīng)用較多。腹腔移植：此方法創(chuàng)傷較小，且可移植較大數(shù)量的干細(xì)胞，但其缺點(diǎn)是干細(xì)胞在腹腔內(nèi)較難存活。Liu等[19]用生物包裹的BMSCs移植到90%肝臟被切除的同種異體小鼠腹腔，小鼠的肝功能改善，生存率明顯提高。外周靜脈移植：Terai等[14]對(duì)9例肝硬化患者通過(guò)外周靜脈將5.20±0.63×109單個(gè)核細(xì)胞注入體內(nèi)，細(xì)胞的存活率超過(guò)了90%，術(shù)后肝功能改善明顯。脾內(nèi)移植：將干細(xì)胞注入脾內(nèi)，干細(xì)胞從脾臟通過(guò)門(mén)靜脈緩慢進(jìn)入肝實(shí)質(zhì)，可以避免從門(mén)靜脈直接注射引起栓塞的可能。Ju等[20]將大約6×106個(gè)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞注入肝硬化小鼠脾內(nèi)，3小時(shí)后在小鼠肝內(nèi)檢測(cè)到骨髓干細(xì)胞。

姚鵬等[16]對(duì)20例慢性肝衰竭患者進(jìn)行自體骨髓干細(xì)胞移植治療，未發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重并發(fā)癥，術(shù)后有輕度惡心1例，發(fā)熱1例；在移植8周后，患者丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、總膽紅素、直接膽紅素均逐漸降低，白蛋白逐漸升高，凝血酶原活動(dòng)度逐漸上升；張強(qiáng)[21]等的研究表明，移植后大多數(shù)患者癥狀明顯改善，腹水減少，食欲改善，體力好轉(zhuǎn)，睡眠改善。其中3例肝硬化Child-Pugh C級(jí)患者取得了較好的療效，提示肝臟損害嚴(yán)重的肝硬化患者肝內(nèi)移植骨髓干細(xì)胞仍然可以獲得較好的效果。Khan等[22]選擇4例肝硬化患者，在自體骨髓干細(xì)胞移植治療術(shù)后6個(gè)月的隨訪中，3例患者血清白蛋白升高、1例無(wú)變化。Terai等[17]報(bào)道在9例肝硬化患者，采用自體骨髓干細(xì)胞外周靜脈注射到患者體內(nèi)，術(shù)后第一天9例患者均出現(xiàn)發(fā)熱（約38℃），無(wú)其他副反應(yīng)。移植24周后觀察發(fā)現(xiàn)所有患者血清白蛋白、總蛋白及Child-Pugh評(píng)分均有顯著提高。Levicar等選擇5例慢性肝病患者，通過(guò)門(mén)靜脈（3例）及肝動(dòng)脈（2例）將自體骨髓干細(xì)胞移植到肝臟內(nèi)，移植細(xì)胞數(shù)量為1×106至2×108之間，連續(xù)隨訪12～18個(gè)月顯示所有接受細(xì)胞移植的患者均較好的耐受了移植治療，其中4例患者白蛋白增加并一直保持不變，所有患者甲胎蛋白均保持在正常范圍內(nèi)，未見(jiàn)肝臟腫瘤及局部肝損害發(fā)生，未見(jiàn)嚴(yán)重的并發(fā)癥和副反應(yīng)發(fā)生[23]。最近，郭曉鐘等報(bào)道，對(duì)78例肝硬化患者行自體骨髓干細(xì)胞移植治療，在移植4周后，患者丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶明顯降低，白蛋白、PTA明顯上升、Child-Pugh評(píng)分顯著提高，腹水明顯減少或消失，乏力納差改善[24]。

通過(guò)目前的臨床觀察，干細(xì)胞移植治療肝硬化已經(jīng)表現(xiàn)出了明顯的治療效果，肝功能得到改善，減少了患者的痛苦，改善了生活質(zhì)量，提高了生存率，并且未出現(xiàn)嚴(yán)重的并發(fā)癥和副反應(yīng)。

五、自體骨髓干細(xì)胞移植治療肝硬化的相關(guān)問(wèn)題

在各種病理?xiàng)l件的微環(huán)境下，干細(xì)胞向各種組織細(xì)胞分化的機(jī)制還不清楚，在移植干細(xì)胞后，會(huì)不會(huì)引起腫瘤細(xì)胞的分化和增殖，還需要通過(guò)長(zhǎng)期的實(shí)驗(yàn)和臨床來(lái)證實(shí)。目前，自體骨髓干細(xì)胞移植治療肝硬化開(kāi)展的時(shí)間才三年多，患者的遠(yuǎn)期療效及是否有其他并發(fā)癥還有待觀察。對(duì)于干細(xì)胞移植治療的適應(yīng)證、禁忌證、移植途徑的選擇、移植干細(xì)胞的數(shù)量、移植次數(shù)等還沒(méi)有相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)，還需要不斷的完善和規(guī)范。

六、展望

二十一世紀(jì)將會(huì)是細(xì)胞治療的時(shí)代，干細(xì)胞移植治療肝硬化的諸多優(yōu)點(diǎn)，使得它非常適合我國(guó)的國(guó)情。我國(guó)的干細(xì)胞臨床治療起步早，開(kāi)展范圍廣，有較好的臨床經(jīng)驗(yàn)，取得了較好的效果，為我們的干細(xì)胞研究奠定了一個(gè)非常好的基礎(chǔ)。同時(shí)，干細(xì)胞移植也為我們?cè)谀承┲匕Y疾病的治療上帶來(lái)了希望，是我們以后基礎(chǔ)研究和臨床治療發(fā)展最前沿的方向。

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