抗菌肽的研究進展

刁昱文,趙紅蕾,高 宇,劉珊珊,馮 新,雷連成,韓文瑜

(吉林大學畜牧獸醫學院,吉林長春,130062)

自從青霉素發現以來,抗生素一直是人類治療病原微生物感染的有力武器,但是由于人類對抗生素的持續使用和濫用,導致很多細菌和病毒對現有的抗生素都產生了耐藥性。NDM-1超級細菌的出現,更是引起了世界對病菌耐藥性問題的極大重視乃至恐慌[1]。歐洲專家預計,至少 10年內沒有抗生素可以有效對付這種細菌,因此呼吁全球密切監控阻止超級細菌傳播,更迫切的需要尋找具有全新機制殺傷病原微生物,且不易形成耐藥性的新型微生物制劑。

1 抗菌肽概述

1950年在弗萊明發現青霉素的同時,在血細胞中首次發現了具有廣譜抗菌活性物質的存在[2]。隨后在巨噬細胞中發現了可以對感染發生作用的細胞內的陽離子抗菌肽,其作用與昆蟲的先天免疫細胞相同[3,4]。1974年,瑞典科學家G.Boman等向眉紋天蠶蛾(Sam ia Cynthia)蛹注入大腸桿菌后,在血淋巴細胞中發現了一種具有抗菌活性的堿性多肽類物質,隨后誘導惜古比天蠶(Hyalophra Cecropia)蛹也發現了類似的抗菌活性物質[5,6]。1981年,這種具有抗菌活性的物質被命名為 cecropin[7],這是人們第一次真正意義上發現抗菌肽。1983年 Lehrer和Selsted從兔的肺巨噬細胞中純化出兩種抗菌肽,隨后被命名為defensins[8]。在隨后的研究中,從哺乳動物、兩棲類、魚類、昆蟲類、鳥類和植物中均發現了抗菌肽[9～13]。

抗菌肽(Antimicrobial peptides,AMPs)是天然免疫系統的重要組成部分,其分子量小、熱穩定性好、抗菌高效廣譜,抗菌機理不同于抗生素,對真核細胞幾乎沒有作用,僅作用于原核細胞,同時不易使病原菌產生耐藥性,而且對真菌、病毒、原蟲和腫瘤細胞有一定殺傷作用,具備新型藥物開發的巨大潛力[15～17],據最新統計,在線數據庫中(http://aps.unmc.edu/AP/main.phe.)已有 2 000多種不同來源的抗菌肽被收錄。

抗菌肽根據內部二級結構和氨基酸不同可分為α螺旋蛋白類、富含色氨酸的 AMPs、含有二硫鍵的 AMPs、富含脯氨酸的昆蟲抗菌肽、Cationic peptide-antisense oligonucleotide Hybrids、陽離子多肽的抗菌擬肽、乳酸桿菌和鏈球菌產生的抗菌肽、多粘菌素[18～20]。

2 抗菌肽的主要研究熱點及發展趨勢

2.1 新型抗菌肽的發現與鑒別

發現并鑒定新型抗菌肽仍是國內外研究者所關注的熱點。隨著研究水平的不斷提高,新型抗菌肽發現的速度與數量與日俱增。目前分離鑒定最直接的方法是通過給予待測生物特定的刺激或不刺激,收集分泌物,以蛋白純化方法直接分離,通過質譜鑒定。將蛋白質組學和肽組學技術運用到抗菌肽的分離與鑒定,是獲得新的抗菌肽的更為可取的方法。構建皮膚組織的 cDNA文庫,結合特定的篩選策略,高通量的篩選特定種類的多肽全長的 cDNA編碼序列,通過基因工程方法進行表達或人工合成來獲得純的抗菌肽進行生物學活性研究。

僅在 20世紀70～90年代,歐洲、美洲、非洲、澳洲的研究者們就對其本土的兩棲類動物皮膚分泌液中的活性化學物質進行了大規模的調查研究和開發利用工作,發現了上百種的兩棲類動物皮膚活性多肽。中國科學院昆明動物所的賴仞等從單個無指盤臭蛙克隆得到了 372條抗菌肽序列,他們編碼 107條新的抗菌肽,分別屬于 30個不同的抗菌肽家族。這一發現使得目前發現的兩棲類抗菌肽數目增加了 2倍 。

2010年,Mechkarska等從去甲腎上腺素刺激負子蟾科非洲爪蛙的皮膚分泌物中,分離鑒定出 9種具有抗菌活性的抗菌肽,其中,1個多肽是 magainin-2的同源類似物,2個是 PGLa的同源類似物,1個雨蛙肽前體,1個爪蟾肽前體,4個 CPF等。研究顯示對 Escherichia coli和 Staphylococcus aureus均有抑菌活性[22]。

本研究室以牛蛙皮膚中提取的mRNA為材料,構建牛蛙皮膚 cDNA文庫。利用 PCR方法對文庫進行篩選。發現 6個新抗菌肽序列,根據序列特征可分為 3個家族:Catesbeianin-1,Ranacyclin,Temporin。對新發現的抗菌肽進行了生物學活性測定,同時發現Temporin對革蘭氏陽性菌有著很好的殺菌作用[23]。

2.2 抗菌肽的設計

抗菌肽分子設計是一個相當活躍的領域,多學科交叉在這里得到了充分體現。伴隨每一種新抗菌肽的發現,都會進行氨基酸序列的修飾,目的是尋找對抗菌活性影響的關鍵部位,并進一步進行分子設計,以期最大限度提升抗菌肽的抗菌活性。對天然抗菌肽進行序列修飾包括以下內容,即增加、刪除、或替代 1個或多個殘基,截取肽鏈N端或C端部分序列,連接不同自然來源的抗菌肽片段成為雜合肽等。

2.2.1 靶向性抗菌肽的設計 在對抗菌肽的抗菌活性研究的同時,有研究者注意到,一些抗菌肽在治療黏膜感染時,并不能對有益菌群和致病菌群進行選擇性殺傷,有益菌群的破壞,很有可能導致二次感染。靶向性抗菌肽的設計,可以只對致病菌進行殺傷,從而維持正常菌群的生長。

Steven A等設計了一個含有固定環狀抗菌肽,基于穩定的胱氨酸 β折疊股框架,這個框架模擬可能的 LPS結合位點,對革蘭氏陰性細菌 E.coli在抗菌肽最低濃度 20 nmol/L時,有著有效的殺菌效果,選擇效果高于革蘭氏陽性細菌S.aureus 200倍[24]。

Eckert等通過化學合成法,將沒有殺滅門多薩假單胞菌(Pseudomonasmendocina)能力的特異性靶向定位區域(KH)與廣譜 AMP(novinspirin G10)融合,合成了能選擇性地殺滅門多薩假單胞菌的G10KHc。G10KHc的靶向定位能力由KH分子與細菌的選擇性結合引起,說明KH選擇性地傳遞G 10KHc至門多薩假單胞菌表面后,AMP區域快速破壞外膜,增強穿透細胞質膜的能力引起細胞死亡[25]。

在 Eckert研究基礎上,He等設計并合成了具有雙靶點特意性的AMM8(KH)-20。體外實驗表明,M8(KH)-20可以對門多薩假單胞菌和變異鏈球菌(Streptococcusmutans)有著特異性靶向殺滅作用,并對共同培養的其它非靶向病原菌的影響較小[26]。

2.2.2 生物信息序列分析 伴隨著生物軟件和相關網站的發展,運用生物信息學手段對抗菌肽進行結構分析、功能預測和新序列設計已經成為生物學與計算機科學交叉運用的熱點。

將化學信息學、生物信息學和相關數據庫聯合應用,可以進行新型抗菌肽的發現與設計、抗菌肽的功能預測、方法分析,對在線搜索結果進行關聯和對比,還可以進行構效關系分析。網站有http://www.expery.Org等,軟件有 Accelrys公司的 Insight II三維圖形環境軟件包。免費軟件:蛋白序列分析軟件包ANTHEPROT,DNASTAR等包括了蛋白質研究領域所包括的大多數內容,功能非常強大,能進行各種蛋白序列分析與特性預測。

Sarah R等應用聚類分析的方法,對具有抗腫瘤活性的抗菌肽,按照靜電荷數目,平均疏水力矩和平均疏水性 3個參數進行了聚類分析。經過分析得出,疏水性是抗菌肽進行穿膜的關鍵因素[27]。

孫雁霞等對 defensin抗菌肽進行了生物信息學分析。一級結構表明其具有典型的昆蟲防御素特征。二級結構分析表明 defensin抗菌肽中主要的結構元件為α-螺旋。通過對不同物種 defensin抗菌肽的分析結果表明,非陽離子抗菌肽的作用機制可能是疏水作用力起主導作用,或者是與細菌胞內酶結構與功能、細菌胞內信號轉導的影響有關[28]。

Tossi等自建的數據庫廣泛收集了 800多條抗菌肽,這些抗菌肽中基于不同的生物來源,能形成兩親α-螺旋的有 150多條。將其 N端 20個氨基酸殘基根據不同類型(電性、極性、螺旋穩定性等)進行統計,得出了序列模板:ghhp+hxpxh+phh+xhhxh[29]。Tiozzo等以該序列模板為基礎,設計出類似于哺乳動物中抗菌肽 cathelicidin家族的新型肽 PGY a(PGY a:G LLRRLRDF LKKIGEKFKKIGY-NH 2)[30]。在此基礎上,G iangaspero等用這個模板研究物理化學參數對活性的影響,通過序列變化合成了 20條肽鏈,得到了一系列具有參考價值的結論,這在某種程度上對多樣性抗菌序列進行了一個總結,為單獨對個別肽鏈進行分子設計提供了參考[31]。

2.3 抗菌肽在先天性免疫中的作用

先天性免疫是提供給有機體對抗致病微生物侵襲的快速的第一道防線。由于抗菌肽可以對多種致病微生物快速發揮功能,所以宿主來源的抗菌肽一直被認為是機體的“天然抗生素”,其特點是來源多樣,并且參與先天性免疫的各個環節而成為新的治療藥物的設計基礎[14,32～33]。

Territo等[34]首次證明,α-defensins是人類單核細胞的趨化因子。Scott等[35]發現了可以選擇性地調節先天性免疫反應的抗菌肽。Scott設計的13個氨基酸的非毒性多肽IDR-1(KSRIVPAIPVSLL-NH 2)可以減弱促炎癥細胞因子的產生,同時促進單核細胞的選擇性聚集,增強和維持單核巨噬細胞炎癥趨化因子水平。

感染或損傷處所分泌的Cathelicidins和defensins對效應細胞具有趨化性,誘導化學激活素的轉錄及分泌和肥大細胞的組胺釋放,這些反應共同促進先天的及獲得性免疫細胞的補充。Cathelicidin家族的抗菌肽能夠抑制致炎細胞因子如TNF-α,IFN-r和 IL-6的相關基因轉錄、促炎癥反應物質的釋放及避免細菌感染后嚙齒類的膿毒癥,還能防止引起組織損傷和炎癥的毒性組分的產生,Cathelicidin家族抗菌肽還可通過調節TLR 4來調節炎癥反應[36]。

2.4 抗菌肽藥物的開發利用

2.4.1 抗菌肽在人類疾病和健康的臨床應用 目前,人類醫學上抗菌肽的研究主要針對皮膚疾病、呼吸性疾病、腸疾病等一些炎性疾病和由致病微生物所引起的感染性疾病。同時,抗菌肽的抗腫瘤活性也已經得到廣泛的認可和關注。

在哺乳動物和人類中已經發現的抗菌肽在人體中主要起的兩個作用已被證實,一是直接的殺菌特性,二是免疫調節特性。應用比較多的兩種抗菌肽是Cathelicidin和 defensins,它們的抗菌活性和多向的在感染和炎癥疾病中的免疫調節作用已被證實。通過具有針對性和系統性的路線進行刺激誘導性給藥而激發內源性抗菌肽,是一種安全的成本低廉的治療方案。同時還避免了合成類似物所產生的副作用和藥物在體內靶向傳遞的困難[37]。

有研究者發現,在皮膚上Cathelicidin對A型鏈球菌有著明顯的抗菌作用,但是在體外實驗中對大腸桿菌 B型鏈球菌和金黃色葡萄球菌的抗菌能力有所降低[38]。α-defensins HNP-1,HNP-2,HNP-3在體外對腺病毒有著很強的抗病毒活性,并且對皰疹病毒、流感病毒和巨細胞病毒均有抑制活性;HNP-4對H IV-1感染也有一定的抑制作用[39]。更多的研究發現 β-defensins,以對抗革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌的感染。另有研究發現,結核桿菌感染的人肺泡巨噬細胞可以誘導 HBD-2的表達,說明 HBD-2在人類結核病的感染中起到一定作用[40]。

抗菌肽已經廣泛的應用在特異性皮炎和銀屑病這兩種皮膚疾病的治療中。通過服用 VD3來誘導體內 LL-37的表達,使用有益菌種或是丁酸鈉來誘導腸內抗菌肽的抗感染和抗炎能力[41]。

抗菌肽可能成為一種新型的藥物載體。兩親性抗菌肽的膜穿透性是其作為藥物運輸載體的基礎,Laszlo Otvos等將分子量小且富含精氨酸殘基的昆蟲抗菌肽 pyrrochoricin和其衍生物作為施藥運載工具,可將抗原性較弱的 9個殘基的MHC-1的抗原表位遞送到小鼠體內,產生很強的細胞毒性 T細胞反應,證實pyrrochoricin同系物具有運載抗原依賴性疫苗的潛力[42]。Magainin與溶于體積分數為 0.50的乙醇的表面活性劑增強劑 N-月桂酰肌氨酸一起可以破壞皮膚角質層中的脂質結構,從而增加了藥物的皮膚透過性,該結果顯示出抗菌肽作為透皮給藥載體具有很好的發展前景[43],進一步探討抗菌肽作為穿膜肽的應用具有廣闊的前景。

抗菌肽的抗腫瘤活性為腫瘤藥物的開發提供了又一個研究平臺。已經證實天蠶素A和B,LL-37/hCAP-18,Magainins,Gaegurins,Aurein 1.2,Citropin 1.1,Melittin(蜂毒肽),Lactoferrici,Tachyp lesin I(鱟素 I),cathelicidin家族中的 PR-39以及一些人工合成的AMPs等有著很好的抗腫瘤活性。在研究AMPs抗腫瘤的同時,研究者通過其對腫瘤細胞的作用機制和對 AMPs本身的改造,使某些抗腫瘤AMPs不僅在抗腫瘤活性上得到提高,并大大增強了 AMPs對腫瘤細胞的靶向性[15]。

雖然始終有大量的研究人員在對天然抗菌肽提取、純化、結構驗證和改造等各方面不斷地做出成績,但是只有一小部分多肽進入臨床試驗階段。幾個很有希望的品種在進行三期臨床試驗階段宣告失敗。比如MSI-78,臨床實驗是用于治療糖尿病性足潰瘍感染,其療效等同于口服氧氟沙星。同樣在臨床三期就宣告失敗的還有 IB-367和 MBI-226。到目前為止還沒有任何抗菌肽或其衍生物被FDA批準上市,多是用作食品添加劑、獸藥。所以研發抗菌肽類藥物還有很長的路要走。目前很多知名藥物研發機構,如Micrologix仍然對抗菌肽類藥物進行著不懈地探索。其中用于治療過敏性痤瘡的多肽類藥物已經進入Ⅱ期臨床實驗階段,用于治療 MRSA引起的鼻腔炎癥也進入Ⅰb期臨床實驗階段。

2.4.2 代抗生素添加劑 根據美國相關科學家聯盟的一項研究表明,美國 70%的抗生素應用于健康的動物,用來增加健康畜禽的體重。2010年 6月 28日,美國食品及藥品管理局(FDA)實施了進一步限制抗生素在動物生產上的措施,主要是因為在動物飼料中常規使用抗生素導致出現抗藥性的新細菌菌株。動物食品安全有賴于生產過程的各個環節,使用無污染、在動物體內無殘留、無毒副作用的添加劑是解決問題的關鍵之一。

抗菌肽是動物體成分之一,參與生命過程是小分子短肽具有安全無毒副作用的生物學特性。抗菌肽眾多的優點為其在獸醫學和飼料科學中的應用指明了作為可代替抗生素的應用方向,尤其是抗菌肽分子量小、熱穩定性強,因此可以耐受飼料制粒時的高溫,規模化發酵生產時,經高溫濃縮工序,可充分殺滅酵母菌體而不導致抗菌肽失活,產品在推廣應用后不會出現工程菌的擴散而導致環境生態問題。

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(責任編輯:石瑞珍)