李斯特菌檢測技術研究進展

龍 川,呂亞楠,錢愛東,趙 權

(吉林農業大學動物科學技術學院,吉林長春,130118)

李斯特菌(Listeriamonocytogenes,LM)最早于 1924年由英國劍橋大學學者從實驗室患敗血癥大鼠和兔子中分離得到[1]。該菌廣泛存在于土壤、人和動物的糞便中,很容易污染食品而引起食物中毒和李斯特病暴發。該菌有著獨一無二的生物學特征,它能在不同的環境條件下生長。例如,它可在 2～4℃下生長,在 -18℃可存活,甚至在反復凍融的條件下仍可存活。該菌最適宜的生長溫度為 30～37℃,最高可忍受 44℃的高溫[2]。由該菌引起的李斯特菌癥能夠使人和動物患腦膜炎、腦炎、敗血癥及造成懷孕婦女流產、死胎等疾病,且病死率很高。常規抗生素治療療效一般。2000年,李斯特桿菌病在法國向人類發起攻擊。法國衛生部門 2010年報道,法國發現 9人因食用熟肉制品而感染了李斯特桿菌病,其中 2人已經死亡[3]。

食品中李斯特菌的傳統檢測方法是將分離純培養后的可疑菌落進行生化反應、動物實驗、典型運動等鑒定,被確定為李氏桿菌后進一步進行血清型分析[4]。傳統的分離方法有FAD法、IDF法、USDA法、冷增菌法(CE)和快速分離程序(RAP-ID程序)。傳統的檢測方法病原的分離率低,耗時較長,敏感性較差。已經越來越不適應人們的生產發展了。

1 血清學檢測方法

血清學檢測具有實驗設備簡單,操作方便,實驗結果較快的特點。很多病原菌用血清學手段都能達到快速的檢測。最初利用血清學方法檢測李氏桿菌的鞭毛抗體,但是本法特異性較差,不能鑒定復雜抗原群,因為本法在李氏桿菌癥病史的動物血清中成陽性反應。Berche Patriek[5]以純化的李斯特菌檢測血清中抗李斯特菌抗體的Dot-blot法,以診斷是否有李斯特菌感染,效果不錯,但存在假陽性。據報道,李氏桿菌與某些大腸桿菌有共同抗原,由于交叉反映普遍存在故很難利用血清學方法準確診斷。用酶免疫分析法(EIA)檢測血清型 1和 4b“M”“O”和“H”抗原,結果與試管凝集試驗相一致,但EIA的滴度高,而且需要的試劑比試管凝集試驗少,應用光密度測定的結果較試管凝集試驗更客觀。

2 PCR方法檢測李氏桿菌

隨著分子生物學的迅猛發展,聚合酶鏈式反應(PCR)方法以其快速、簡便、特異性高的特點,在生物學的各個領域發揮著越來越重要的作用。Paillard.D和 Fitter S根據限制性片段長度多態性的原理,用 PCR方法擴增出李斯特氏菌的23SrRNA的兩段保守序列,并通過比較各擴增出來的限制性片段長度來檢測李斯特氏菌,可達到區分李斯特氏菌不同種的水平[6,7]。依據李氏桿菌 hlyA基因序列設計引物,利用富集培養結合 PCR擴增的方法檢測食品中的 LM,僅需要 24 h或 2 d。Wieckowska.M根據 hly基因建立 PCR法檢測牛奶中的李斯特菌,檢測靈敏度為 50 cfu/L。Cocolin[9]建立了 1種新的檢測鑒定食品中 L.spp和LM的分子方法。用來自 5個種的iap(invasion associated protein)基因擴增片段和PCR產物的變性梯度膠電泳(DGGE),使 5個種容易得到快速分離和鑒定。近年來,實時熒光 PCR技術檢測 LMO更快速、敏感、特異,同時能有效地克服食品基質、培養基成分和雜菌對常規 PCR檢驗的干擾作用[10]。

3 單克隆抗體法檢測李氏桿菌

單克隆抗體這項技術一經問世就從根本上解決了在抗體制備中長期存在的特異性和可重復性問題。使抗體的規模性生產成為可能。人們嘗試制作一種特異性單克隆抗體,能特異的和單核增生性李氏桿菌結合,用于食品的檢測。目前根據不同抗原建立了很多檢測方法。Butman在1988年報道了巧株李斯特氏菌屬特異表位的單克隆抗體,用以上單抗構成的夾心 ELISA檢測方法能于前增菌后24 h內報道檢出結果,最低菌濃度檢出為 5×108cfu/L[11]。焦新安[12]在 1994年應用 3株李斯特菌屬特異單抗檢測試劑,建立了快速檢測李斯特菌的間接免疫熒光和夾心ELISA方法。蔣原等[13]運用淋巴細胞雜交瘤技術獲得4株雜交瘤細胞可分泌抗李斯特菌屬表位單抗的,特異性高,與其它菌無交叉反應。

4 儀器法檢測單克隆抗體

全自動微生物分析系統是用儀器檢測李氏桿菌的方法,首先用常規法篩選可疑菌落,然后用儀器鑒定,國內外現在已有很多全自動微生物分析系統,如BITEK-AMs系統、vitek系統、Midd系統、Biolog系統、Autosceptor系統等。國際分析化學協會(AOAC)把BITEK-AMS系統列為法定分析法。據報道用Vitek微生物自動分析儀進行李斯特菌鑒定,與傳統方法相比,符合率 100%,僅需 7～14 h就能檢測出結果,具有快速、準確等優點[14]。據美國農業部研究報告稱,用“流式細胞儀”可 1次準確檢測出 100個李氏桿菌樣品,可更快速、方便、準確地檢測李斯特菌。雖然儀器方法操作簡便,準確率也很高,但仍有它的局限性,此種方法是建立在成熟實驗人員篩選可疑菌落之上的。

5 討 論

未來很長的一段時間內,李斯特菌病仍將是世界性的公共衛生問題。我國的李斯特菌癥防制仍面臨著巨大的挑戰。客觀技術條件的制約以及細菌病原的復雜性,李斯特菌的快速準確檢測仍是困擾研究人員的一大難題。環境中李斯特菌的大量存在和李斯特菌癥的高致死率,使實現快速準確檢測成為亟待解決的問題之一。傳統方法敏感性差,耗時長已不能適應時代變化。

新的生物技術手段的應用,為解決這一問題打開了另一扇大門。傳統的蛋白層面的研究由于受復雜抗原性的影響,特異性較差。基因層面特別是熒光 PCR技術和核酸探針等技術的成熟,使研發一種快速準確的檢測方法成為可能。國內外學者做出了很多嘗試,取得了一定的成效。但由于受技術層面的影響不能普及。在我國如何因地制宜,多種檢測手段綜合利用,為李斯特菌病的預防和診斷做出有效的技術支持,是我國需要解決的問題。

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(責任編輯:石瑞珍)