廣西牛群戊型肝炎病毒感染情況調查

李 斌 ，蘇乾蓮 ，趙 武 ，秦毅斌 ，梁家幸 ，何 穎 ，梁保忠 ，嚴子斌 ，覃 勇 ，韋建華 ，段群棚 ，許力匆

（ 1. 廣西獸醫研究所，廣西南寧 530001；2. 橫縣動物疫病預防控制中心，廣西橫縣 530300；3. 百色市動物疫病預防控制中心，廣西百色 533000；4. 河池市動物疫病預防控制中心，廣西河池 547000 ）

養牛業是廣西的優勢和特色產業，但至今尚未見廣西牛HEV感染檢測的相關報道。本研究應用反轉錄—套式聚合酶鏈式反應（RT-nPCR），對采自廣西8個市牛糞、肝樣品進行HEV檢測，為廣西牛群HE的流行病學研究及監測防控提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 牛糞、牛肝樣品

采自廣西8個市的奶牛場、屠宰場、菜市場的新鮮牛糞樣品183份、新鮮牛肝樣品25份。

1.2 HEV RNA檢測的陽性、陰性對照

陽性對照：經RT-PCR檢測和核苷酸序列測定為HEV陽性的豬糞病料；陰性對照：本實驗室采集的，經RT-PCR檢測為豬流行性腹瀉病毒（PEDV）陽性的豬糞病料。

1.3 RNA抽提及RT-PCR試劑

Trizol Reagent購 自Invitrogen公 司，M-MLV逆轉錄酶購自Promega公司，RNA酶抑制劑購自寶生物工程（大連）有限公司，Taq酶購自Fermentas公司，dNTPs購自生工生物工程（上海）有限公司，DNA Marker購自廣州東盛生物科技有限公司，DEPC H2O自己制備。

1.4 引物合成

根據基因Ⅰ-Ⅳ型HEV的ORF2基因序列，合成兩對簡并引物進行RT-nPCR[1]，這兩對引物可擴增四種基因型HEV的ORF2保守區內基因序列，其內套PCR擴增產物大小為436 bp。引物序列如下，外套引物HEV-A：5'-TAYCGHAAYCAAGGHTGGCG-3'，HEV-B ：5'-TG YTGGTTRTCRTARTCCTG-3'；內套引物HEV-C：5'-AC YTCHGGBGTBGCKGAGGA-3'，HEV-D：5'-GCTCGCC ATTGGCTGAGAC-3'，引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.5 RNA模板的提取

用Trizol Reagent對處理好的牛糞、牛肝樣品及HEV陽陰性對照病料進行總RNA的提取。

1.6 反轉錄

RT反應采用25 μL反應體系，其組成如下：5×RT Buffer 5 μL，dNTPs（10 mmol/L）2 μL，引 物 HEV-B（25 μmol/L）1μL，RNA 酶 抑 制 劑（40U/ μL）0.5 μL，M-MLV 逆轉錄酶（200U/ μL）0.5 μL，RNA 模板 16 μL。RT反應條件：42 ℃ 60 min，最后終止于4 ℃。

1.7 套式PCR擴增

套式PCR反應采用25 μL反應體系，外套PCR組成 如 下 ：DEPC H2O 17.6 μL，10×Dream Taq Buffer（includes 20 mmol/L MgCl2） 2.5 μL，dNTPs（10 mmol/L）0.5 μL，外 套 PCR 引 物 HEV-A、HEV-B（25 μmol/L）各 0.5 μL，Dream Taq 酶（5U/ μL）0.4 μL，cDNA 模 板3 μL ；內套 PCR 組成如下 ：DEPC H2O 17.6 μL，10×Dream Taq Buffer （includes 20 mmol/L MgCl2）2.5 μL，dNTPs（10 mmol/L）0.5 μL，內 套 PCR 引物 HEV-C、HEV-D（25 μmol/L）各 0.5 μL，Dream Taq 酶（5U/ μL）0.4 μL，外套 PCR 產物模板 3 μL。外、內套PCR均為相同的反應條件：95 ℃預變性5 min，進入循環95 ℃ 50 s→53 ℃ 50 s→ 72 ℃ 1 min，35個循環，72 ℃延伸10 min，終止于4 ℃。

1.8 PCR產物的檢測

取 20 μL 內 套 PCR 擴 增 產 物，加 入 4 μL6×Loadding Buffer，于混有EB替代物的1%瓊脂糖凝膠中以120 V 100 mA電泳40 min，于紫外燈下觀察電泳結果，并于凝膠成像系統拍照保存結果。

1.9 檢測結果統計分析

應用統計學軟件SPSS13.0對廣西8個市樣品牛HEV檢測陽性率結果數據進行單樣本非參數檢驗（卡方檢驗），對分別檢測廣西牛糞、牛肝樣品HEV檢測陽性率結果數據進行兩獨立樣本非參數檢驗（Mann-Whitney U 檢驗）[2]。

2 結果

2.1 RT-nPCR擴增產物電泳結果

檢測HEV為陽性的牛糞、牛肝樣品和HEV陽性對照病料的內套PCR擴增產物經電泳后都可見436bp特異性目的條帶，而陰性對照病料的內套PCR擴增產物經電泳后則無此條帶（圖1）。

2.2 RT-nPCR檢測廣西8個市樣品牛HEV結果統計分析

在所檢廣西8個市樣品中，HEV陽性率最高的是梧州市（72.73%），陽性率最低的是百色市（0%）。其余6個市樣品的檢出HEV平均陽性率為15%（24/160）（表1）。用統計學軟件SPSS13.0對廣西8個市樣品牛HEV檢測陽性率結果數據進行卡方檢驗（Chi-Square Test），結果卡方值 χ2=122.414，相伴概率（Asymp.Sig.）P=0.000，小于顯著性水平0.05，所以廣西8個市樣品牛HEV檢測陽性率存在顯著性差異。這可能與各地樣品的檢測數量及樣品是否采自牛HEV排毒期等因素相關。

2.3 RT-nPCR分別檢測廣西牛糞、牛肝樣品HEV結果統計分析

應用RT-nPCR所檢測的廣西6個市牛糞HEV的陽性率最高為87.5%（14/16），最低為0%（0/20），平均陽性率為19.13%（35/183）；所檢測的廣西4個市牛肝HEV的陽性率最高為33.33%（2/6），最低為0%（0/6），平均陽性率為 20%（5/25）（表 2）。用統計學軟件SPSS13.0對牛糞、牛肝樣品HEV檢測陽性率結果數據進行兩獨立樣本的Mann-Whitney U檢驗，結果該法的Z檢驗統計量Z=-0.430，雙側檢驗相伴概率（Asymp. Sig.）P=0.667，單側檢驗 P=0.333 5，大于顯著性水平0.05，因此分別檢測廣西牛糞、牛肝樣品的HEV檢測陽性率差異不顯著。

表1 廣西8個市樣品牛HEV檢測結果

表2 分別檢測廣西6個市牛糞、4個市牛肝樣品的HEV檢測結果

3 討論

對廣西8個市牛糞、肝樣品HEV RNA檢測結果表明，梧州市樣品牛HEV陽性率很高，為72.73%（16/22）；而百色市樣品牛HEV陽性率為0%（0/26）。對廣西8個市樣品牛HEV陽性率差異進行統計分析，結果P＜0.05，表明廣西8個市牛HEV感染率的差異顯著。這可能與檢測樣品的數量、樣品的代表性有關，也可能與廣西這8個市的地形環境、氣候條件、養牛業狀況及牛相關產品流通等因素的差異有關。

應用RT-nPCR從廣西6個市牛糞樣品中檢出HEV的陽性率為19.13%（35/183），從廣西4個市牛肝樣品中檢出HEV的陽性率為20%（5/25）。對兩種不同樣品檢出HEV陽性率的差異進行統計分析，結果P＞0.05，表明從兩種樣品檢出HEV的陽性率差異不顯著。而且從牛糞檢測HEV RNA較之從牛肝檢測HEV RNA有2個優點：（1）牛糞可方便地采樣，不用殺牛取肝，牛糞的采樣成本很低；（2）牛糞可直接稀釋離心取上清用于檢測，而牛肝則需磨碎、凍融處理后離心取上清用于檢測，牛糞樣品處理較為簡易。所以牛糞HEV RNA檢測更適于作為牛群HE的病原監測手段。

[1] 王彤. 醫學統計學與SPSS軟件應用[M]. 北京： 北京大學醫學出版社， 2008.

[2]li W, She R, Wei H, et al. Prevalence of hepatitis E viurs in swine under different breeding enviromnent and abattoir in Beijing, China[J]. Vet Microbial, 2009,133(1/2):75-83.