雞胚致病性大腸桿菌的分離與鑒定

劉國慶，溫建新，趙鵬偉，李倩倩，劉 坤

（1.膠南市動物疾病控制中心，山東青島 266400；2.青島農業大學動物科技學院，山東青島 266109；3.中國動物衛生與流行病學中心，山東青島 266032）

2011年4月，在膠州某種雞場19日齡雞胚死亡數量增加，經剖檢時可見卵黃吸收不良，大多為黃綠色物質，肝臟腫大出血，經過分離培養、生化試驗和溶血試驗確診為致病性大腸桿菌，通過藥敏試驗檢測了病原菌對藥物的敏感性，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源 膠州某種雞場的一批待檢的19日齡病死雞胚。

1.1.2 試驗材料 普通營養瓊脂培養基、肉湯培養基、伊紅美藍培養基（EMB）、三糖鐵培養基（TSI）、用兔血配制的血平板培養基、檸檬酸鹽瓊脂、葡萄糖蛋白胨水；五糖發酵管（葡、麥、蔗、乳、甘）、H2S、靛基質、MR試劑、VP試劑、吲哚試劑、藥敏紙片（購自杭州天和微生物試劑有限公司）；E.coli標準“O”血清、標準菌株均購自中國獸醫藥品監察所。

1.2 方法

1.2.1 病理剖檢 隨機抽取42只雞胚，觀察尿囊液的變化及內臟的病理變化。

1.2.2 細菌的分離、純化及形態學觀察 將病料分別無菌接種到肉湯培養基上，37 ℃培養24 h后，用滅菌環挑去肉湯中的培養物分別接種到EMB培養基上，37 ℃培養24 h。挑去EMB培養基上的單個菌落進行革蘭氏染色，鏡檢。

1.2.3 生化試驗 挑取在經革蘭氏染色后呈陰性短桿菌的EMB黑色帶有在金屬光澤菌落在普通營養瓊脂培養基上進行純化培養后，按照常規方法進行TSI、糖發酵試驗[1]、IMViC。

1.2.4 溶血性試驗 從EMB培養基中挑取單個菌落接種到兔血配制的血平板上，置于37 ℃培養24 h，觀察培養基中是否產生溶血現象。

1.2.5 藥敏試驗 采用紙片擴散試驗法。其操作方法如下：將分離得到的大腸桿菌和標準菌株在無菌條件下分別接種于肉湯中，然后放入搖床中培養 12 h 后計數，調節菌液的含菌量為108個/mL。按常規操作貼好紙片置于 37 ℃培養 12 h 后觀察結果。

2 結果與分析

2.1 剖檢變化

剖檢時可見卵黃吸收不良，大多為黃綠色物質，肝臟腫大出血，羊膜腔出血

2.2 細菌的分離培養

經37 ℃培養在肉湯中均出現渾濁，管底有黏性沉淀，液面管壁有菌環；在EMB培養基上出現黑色帶有金屬光澤的菌落；挑取得單個菌落接種到普通培養基上形成表面光滑、濕潤、半透明、灰白色、圓形凸起、中等大小菌落

2.3 細菌形態學觀察

經革蘭氏染色鏡檢后，均可見粉紅色、兩端鈍圓、多數散在排列的革蘭氏陰性短桿菌。

表1 病原菌生化試驗結果

2.4 生化試驗結果（見表1）

由表1可見，從雞胚尿囊液和肝臟中分離的細菌都利用葡萄糖、乳糖、麥芽糖和甘露醇，但不利用蔗糖；吲哚試驗出現玫瑰紅色，說明呈陽性，不產生H2S；枸櫞酸鹽不變色，呈陰性；MR試驗中液體呈現紅色，說明呈陽性；VP試驗觀察到沒有顏色變化，說明呈陰性；TSI斜面、底部均為黃色，底層產氣。經過以上生化試驗，可以確診該批雞胚感染了大腸桿菌。

2.5 溶血試驗結果

血平板上出現明顯的溶血現象，說明分離到的大腸桿菌具有致病性。

2.6 藥敏試驗結果（見表2）

表2 藥敏試驗結果

3 討論

3.1 對生化試驗和溶血試驗結果的討論

本試驗通過分離培養和染色鏡檢觀察細菌形態疑似該病原菌為大腸桿菌后，把分離到的細菌進行生化試驗，該菌能夠利用葡萄糖、乳糖、甘露醇、麥芽糖產酸，而不能利用蔗糖。典型的大腸桿菌一般都對葡萄糖和乳糖產酸產氣，但可能不同血清型的細菌可能生化反應不完全一致。在進一步做IMViC試驗的結果與大腸桿菌的生化特征基本一致。可以進一步確診該批雞胚是感染大腸桿菌致死。另外，血平板上出現明顯的溶血現象，說明大腸桿菌具有一定的致病性。

3.2 致病性大腸桿菌耐藥性的變化

大腸桿菌極易產生耐藥性，不同地區致病菌的耐藥性差異較大。從分離得到的致病性大腸桿菌藥敏結果可以看出；對美福仙高度敏感，對慶大霉素、先鋒V中度敏感，而對克林霉素、環丙沙星、阿米卡星、萬古霉素、紅霉素、氯霉素、氨芐青霉素、四環素和青霉素G不敏感。可以考慮用美福仙、慶大霉素、先鋒V藥物對雞大腸桿菌病進行治療。因此，通過藥敏試驗進行治療十分有效的，不僅能測定細菌對藥物的敏感性，且有助于選擇合適的藥物，為藥物的用量提供依據[2-3]。然而在臨床治療中投藥的劑量不足，用法不當，無明確適應癥而濫用抗菌素類藥物，特別是長期應用時，往往引起耐藥菌株的產生高敏抗生素的長期使用，必定會產生耐藥性的菌株[4]。雞大腸桿菌病產生耐藥性的原因據記載：在臨床治療大腸桿菌病時，必須注意合理使用藥物，加強抗生素藥物的質量監督，注意細菌耐藥性的檢測，有效的限制耐藥性的產生；同時，要加強不同抗生素的聯合使用。總之，細菌耐藥性是目前養殖業所面臨的重大問題之一。

3.3 對防治雞胚感染大腸桿菌的建議

大腸桿菌是條件性致病菌，危害養殖業的重要病原菌，凡能引起機體抵抗力降低的各種因素均是引發本次疾病的原因，特別是各種病毒的感染，都可以誘發大腸桿菌病。防治該病的關鍵在于貫徹“養重于防，防重于治”的方針[5]。

因為雞胚感染大腸桿菌主要是母體垂直傳播或外界環境污染所致，所以要預防雞胚感染大腸桿菌要從預防種雞感染大腸桿菌和減少雞胚受環境污染方面采取措施。①加強飼養管理，禽舍及用具經常進行清潔和消毒。尤其種禽必須在嚴格的衛生條件下飼養，預防性用藥并不能代替良好的科學飼養[6]。②日常要提供全價優質飼料，并足量補充維生素和電解質，夏季注意防暑。③要注意育雛期保溫及飼養密度，及時隔離病弱雛，死雛要及時檢出。④一定要控制糞便污染，因為污染的種蛋很容易造成傳播疾病。⑤進行免疫接種。由于禽的致病性大腸桿菌的血清型繁多，會造成疫苗保護率偏低，因此應在疫苗防制之前對當地養殖場內致病性大腸桿菌進行監測，然后選擇合適的疫苗進行免疫。

大腸桿菌的特點是易形成抗藥性，而且大腸桿菌可通過菌毛將其抗藥性質粒傳遞給其他大腸桿菌，所以大腸桿菌的抗藥性形成較快，環境中大腸桿菌耐藥性菌株越來越多[7]。對于感染大腸桿菌的治療，為了減少細菌耐藥性的產生，應先做細菌藥敏試驗，再合理選擇用藥，既縮短治療時間，又避免濫用抗生素，同時要注意交替用藥，按療程投藥，以最大限度減少養殖戶的經濟損失。

[1] 姚火春.獸醫微生物學實驗指導[M].北京：中國農業出版.2002：36-39.

[2] 汪毅，劉永德，劉帥，等.雞大腸桿菌分離鑒定與藥敏試驗[J].上海畜牧獸醫通訊，2001（4）：19.

[3] 胡桂學.獸醫微生物學實驗教程[M].北京：中國農業出版社，2006：61.

[4] Gaastra W，Great F K.Host-specific Fimbrial Adhesions of Noninvasive Enterotoxigenic E.coli strains[J].Microbiological reviews，1982，46（2）：12-16.

[5] 郭振環，孔祥峰，黃小燕，等.雞大腸桿菌病的病原菌分離鑒定和藥敏試驗[J].安徽農業科學，2007，35（2）：443.

[6] 孫海虹.禽大腸桿菌病的特性與防治[J].醫學動物防制，2005，21（6）：460-462.

[7] 刁有祥，李久芹，陳慶普.山東省雞大腸桿菌的分離鑒定[J].中國預防獸醫學報，2002，24（1）：21-23.