煮沸裂解法快速提取Tg2576小鼠DNA

于東明 王思謙 范媛媛 鄧錦波△

河南大學醫學院 1）神經生物學研究所 2）護理學院 開封 475004

Tg2576小鼠，即APPSWE轉基因小鼠，是一種研究阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）病理變化及治療的常用轉基因動物模型。該模型鼠在Aβ的沉積、淀粉樣斑塊的形成、神經元退變和記憶丟失等方面表現出許多與AD患者的相似性［1－2］。對其子代鼠進行準確快速的基因鑒定，是該鼠保種、繁育以及進行下一步AD研究的基礎。李國營等［3］采用的單一引物PCR來檢測子代鼠的基因型和本實驗室在實驗中引入內源性參照引物β－actin以減少假陰性結果而采用的雙重引物PCR鑒定基因型［4］，是目前對該轉基因鼠基因型鑒定的常用方法。但是，無論單一引物或者雙重引物PCR鑒定子代鼠的基因型，都是采用的酚／氯仿法提取DNA，該方法步驟繁瑣，耗時較長。本研究借鑒煮沸裂解法制備質粒DNA方法，改進后用于提取Tg2576轉基因小鼠體細胞DNA，力圖建立一種快速、簡便、高效的DNA提取方法，為進一步的AD實驗研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑 APPSWE雜合子鼠（Tg2576，美國Taconic公司），購自南京大學模式動物研究所。待鑒定子代鼠，由雄性Tg2576與雌性C57BL／6小鼠交配而得。

2×PCR Mix、DNA marker DL2000購自廣州東勝生物科技有限公司；PCR引物由上海生工生物技術有限公司合成；Du Red核酸染料（EB替代品）購于北京泛博生物化學有限公司；其他試劑為Sig ma產品或國產分析純。

1.2 體細胞DNA的提取

1.2.1 酚／氯仿法：第1天：子鼠出生后10 d，剪0.5 cm 鼠尾置1.5 mL離心管內，編號。加0.5 mL DNA提取緩沖液（0.15%SDS、15 mmol／L NaCl，15 mmol／L Tris－HCl、15 mmol／L EDTA、20 mg／L 胰 RNA 酶），加5μL 10 mg／mL蛋白酶K，55℃消化過夜。

第2天：將消化好的組織充分搖勻；每管加入250μL（1／2消化液的體積）飽和氯化鈉溶液；混勻，離心，12 000 rp m，10 min（此時會見到很多白色的沉淀，這些都是蛋白沉淀）；轉移400μL上清至新的標記好的1.5 mL EP管內；加入800 μL無水乙醇（2倍于上清的體積），上下顛倒混勻，此時應可看到白色絮狀的DNA沉淀；離心，12 000 r p m，5 min；棄去上清；加入800μL 70%乙醇；離心，12 000 rp m，5 min；棄去上清；自然晾干，不少于30 min；加入200μL TE，可放入37℃助溶；按需要取適量DNA進行后續PCR操作；短期4℃保存。

1.2.2 煮沸裂解法：首先配 A、B兩種裂解液。A液：NAOH 1 g，EDTA二鈉0.093 g，純水加至1 L；B液：Tris－HCl 6.3 g，調p H 3.0，純水加至1 L。所配裂解液可取100 mL置室溫作為日常使用，其余放在4℃保存。

取上述酚／氯仿法所用同幾只小鼠，剪0.3～0.5 cm鼠尾置1.5 mL EP管內，編號與酚／氯仿法一致。每個EP管內加入75μL A液，100℃沸水浴45 min；煮好后取出至涼，在EP管內加入225μL B液，漩渦震蕩數秒，離心，10 000 r p m，2 min，取上清液；按需要取適量DNA進行后續PCR操作；短期4℃保存。

1.3 PCR 反應

1.3.1 引物：采用Tg2576小鼠的特異性引物（APP引物），上游引物：5’－CTG ACC ACT CGA CCA GGT TCT GGG T－3’；下游引物：5’－GTG GAT AAC CCC TCC CCC AGC CTA GAC CA －3’。

1.3.2 PCR擴增：兩種方法所提DNA采用同條件PCR反應體系擴增。采用50μL PCR體系，包括：待測DNA 2μL、APP引物上、下游（10μm）各2μL、2×PCR Mix（組分：100 mm KCl、20 mm Tris－HCl、3 mm Mg Cl2、400μm d NTP混合物、0.1 U／μL Taq DNA聚合酶、溴酚藍以及其它增強劑與穩定劑）25μL、超純水補足50μL。循環條件：預變性94℃5 min；變性94℃45 s，退火57℃1 min，延伸72℃1 min，共30個循環；最后延伸72℃10 min，4℃保存。

1.4 瓊脂糖凝膠電泳 1.2%瓊脂糖凝膠電泳，Du Red核酸染料染色，90～100 V，30 min。電泳后的凝膠即放入GE Healthcare凝膠成像系統內拍照，觀察PCR結果。

2 結果

在小鼠鑒定過程中，使用酚／氯仿法和煮沸裂解法提取DNA，經PCR反應后，瓊脂糖凝膠電泳示基因型鑒定結果二者一致，且PCR產物分子量大小與目的片段均一致（圖1）；但前者操作繁瑣，至少需2 d完成；而后者操作步驟大大簡化，可在1 d內輕松完成，提取DNA所用試劑毒性小、成本低，且提取結果可以與前者方法相媲美。

圖1 Tg2576小鼠PCR檢測結果

圖1 A 酚／氯仿法提取DNA結果；圖1B 煮沸裂解法提取DNA結果。M 為DNA mar ker DL2000；3，6，7，8：Tg2576陽性鼠（＋／－）；1，2，4，5：Tg2576陰性鼠（－／－）。

3 討論

AD是老年人多發的進行性神經退行性疾病，臨床主要表現為進行性認知功能下降和近期記憶障礙，目前尚無有效的治療方法。缺少合適的動物模型是AD研究的主要障礙，構建合適的動物模型對AD的研究至關重要［5］。AD的病因復雜，在家族性老年性癡呆患者（FAD）中已鑒定出多個APP基因的突變位點，其中h APP695雙突變（K670 N、M671L，Sweden突變）是 FAD 瑞 典 家系的發病原 因［6］，1996年Hsiao等［1］根據FAD瑞典家系的上述遺傳病理特征，構建了轉入基因，產生子一代的AD轉基因模型鼠，并選育成能穩定遺傳APPSWE基因的雜合子鼠Tg2576。

在小鼠基因型鑒定過程中，DNA的提取是關鍵的一步。酚／氯仿法是DNA的提取中應用較為廣泛的方法，其對新鮮樣品的提取效果比較好，但使用試劑復雜、步驟繁瑣，至少需2 d完成。本實驗借鑒煮沸裂解法制備質粒DNA方法，改進后來替代傳統的酚／氯仿法，用于提取Tg2576小鼠DNA。電泳結果顯示該方法與酚／氯仿法鑒定結果相符，且PCR產物分子量大小與目的片段一致（圖1），實驗操作簡單、不需昂貴的儀器設備、用時短、所用試劑毒性小。本實驗成功改進了Tg2576小鼠DNA的提取方法，為進一步的AD實驗研究奠定了基礎。同時該方法也適用于PCR擴增及后續分析，值得在其他轉基因小鼠鑒定實驗中推廣。

［1］Hsiao K，Chap man P，Nilsen S，et al.Correlative memory deficits，A elevation and amyloid plaques in transgenicmice［J］.Science，1996，274（5284）：99－102.

［2］Kawarabayashi T，Shoji M，Younkin L H，et al.Di meric a myloid beta protein rapidly accu mulates in lipid rafts followed by apolipopr otein E and phosphorylated tau accu mulation in the Tg2576 mouse model of Alzhei mer＇s disease［J］.J Neur osci，2004，24（15）：3 801－3 809.

［3］李國營，張革，胡金家，等 .APPSWE轉基因鼠的繁育及子代鑒定的研究［J］.中國病理生理雜志，2004，20：113－116.

［4］范文娟，程維杰，牛艷麗，等 .雙重引物PCR鑒定APPSWE轉基因小鼠［J］.神經解剖學雜志，2009，25（1）：84－86.

［5］趙荷劍，張善鋒，高林 .酸性肽對AD大鼠學習記憶功能及NGF和NMDAR1表達的影響［J］.中國實用神經疾病雜志，2009，12（1）：11－14.

［6］Cai XD，Golde TE，Younkin SG.Release of excess amyloid protein from a mutant amyloid protein precursor［J］.Science，1993，259（5094）：514－516.