同種異體牙移植的免疫抑制功能研究*

金光春 李言君 周 聰 姜 玲 薛江南 李升鐘 金東春

1.濱州醫(yī)學(xué)院，山東煙臺 264003；2.韓國延世大學(xué),首爾 120-752；3.延邊大學(xué)，吉林延吉 133000

異體牙移植免疫排斥反應(yīng)的存在導(dǎo)致牙根吸收、根管治療失敗、繼發(fā)感染等并發(fā)癥，限制了它們的臨床應(yīng)用，是影響移植牙長期存活的重要因素。如何消除或降低異體牙移植后的免疫排斥反應(yīng)及如何進一步提高異體牙移植的成功率，國內(nèi)外研究者采用不同的方法處理異體牙，亟待解決并發(fā)癥等問題。而且報道不盡相同，尚無統(tǒng)一的定論[1]。本研究旨在通過動物實驗進行同種異體牙移植的研究，減少免疫排斥反應(yīng)，為異體牙移植術(shù)的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 對象與方法

1.1 實驗對象

隨機選擇14只雄性白鼠（28顆上頜左右第1磨牙）為異體牙供者，體重16～24 g。隨機選擇14只雌性白鼠（28顆上頜左右第1磨牙）為移植牙受體者，體重16～22 g。分成具有相同抗原性和不同抗原性兩類。所有白鼠均經(jīng)過血液抗原性確認，均為4周齡的Sprague-Dawley系，由韓國延世大學(xué)口腔科學(xué)研究所提供。

1.2 保存溶液

Viaspan溶液(Dupont Pharma,Willmington,DE,USA)

1.3 靶細胞

采用Sp-20骨髓瘤細胞。

1.4 生物化學(xué)試劑及反應(yīng)試劑

溴化二苯四偶氮鹽[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2.5-diphenylte-trazoliumbrom ede，MTT]，兔補體，蛋白水解酶。反應(yīng)試劑是采用10%二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide,DMSO/Sigma Chemical Co.,St.Louis,USA）。

1.5 方法

1.5.1 牙移植術(shù) 采用Ketamine（0.1 mL/100 mg, Jaeil Jae Dang,Korea）藥物麻醉后，用探針進行牙齦分離，盡量減少對周圍組織損傷的情況下，用特制的拔牙鉗子拔除異體牙供者的左右上頜第1磨牙，移植于受體。

1.5.2 效應(yīng)細胞的制備 無菌條件下取出同種異體移植組和接受組白鼠脾臟在骨鑿器上磨碎，收集溢出的淋巴細胞，使用60% Pecoll充分分離淋巴細胞。

1.6 組織學(xué)觀察

牙移植術(shù)后分別于1、2、4、8斷頸法處死動物（按時間段處死7只），摘除頜骨，10%福爾馬林固定24 h，在5%硝酸脫敏溶液中脫敏5 d。以牙齒長軸1 mm的間隔垂直切片，制備5 μm標本，用HE染色并觀察牙根吸收程度及周圍移植區(qū)的免疫排斥反應(yīng)。

牙根吸收評價基準：①normal periodontium（正常牙周膜）；②surface resorption（表面吸收）；③inflammatory resorption（炎癥吸收）；④replacement resorption（復(fù)位吸收）。

1.7 ACMC與CMC免疫反應(yīng)的免疫學(xué)觀察

標本二甲苯溶液中浸泡30 min，去除石蠟，用95%、90%、70%酒精與蒸餾水按順序處理，用0.1%胰島素酶處理，露出抗原部位，并在山羊血清中反應(yīng)30 min，應(yīng)用生物素染色（avidin-biotin staining）法免疫組織化學(xué)驗色,用磷酸鹽緩沖鹽水（phosphate buffered saline）清洗并DAB kit顯色，光學(xué)顯微鏡觀察ACMC（宿主主抗體-補體介導(dǎo)細胞殺傷）與CMC（細胞介導(dǎo)的細胞殺傷）免疫反應(yīng)。觀察期為1周，每個時間段的觀察點是7只白鼠，分離血清，制備抗體。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 11.0進行統(tǒng)計分析，通過Student-Newman-Keuls 法計量數(shù)據(jù),計量資料用（± s）表示，P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

同種異體移植牙術(shù)后1周開始觀察大多數(shù)牙根吸收及周圍移植區(qū)的免疫排斥反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)牙根周圍引流的免疫細胞反應(yīng)。在牙根周圍的單核細胞浸潤，以及局部淋巴結(jié)內(nèi)產(chǎn)生淋巴母細胞。移植牙受體區(qū)域纖維血管組織長入，根尖周圍牙周韌帶細胞大量破壞，組織血管吸收、壞死，大量的T淋巴細胞和巨噬細胞浸潤的炎癥反應(yīng)。牙骨質(zhì)呈現(xiàn)大面積的牙根吸收，根吸收區(qū)分布著大量破骨細胞。分布于骨質(zhì)表面，形成骨吸收窩陷。免疫檢測發(fā)現(xiàn)ACMC和CMC反應(yīng)水平牙移植術(shù)后1周開始明顯提高，術(shù)后1～2個月可持續(xù)增加，見圖1。ACMC、CMC與同基因移植牙有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表1。觀察明顯的牙根周圍吸收，可見大量的破骨細胞分布在牙槽骨吸收陷窩內(nèi)。

表1 同種異體牙移植術(shù)后牙根周圍的免疫排斥反應(yīng)(HE與免疫檢測)變化

圖1 牙根吸收程度及周圍移植區(qū)的免疫排斥反應(yīng)

3 討論

器官移植是指通過外科手段，將他人的具有活力的器官移植給患者以代替其病損的器官的手術(shù)。20世紀，器官移植技術(shù)隨著外科手術(shù)、免疫抑制藥物、器官和細胞分離保存技術(shù)及移植免疫學(xué)基礎(chǔ)的迅速發(fā)展，特別是發(fā)達國家現(xiàn)已成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一門新興學(xué)科，取得了豐碩的成果和巨大進展。牙移植術(shù)是將自體的或異體的牙齒移植到剛拔除的其他牙的牙槽窩內(nèi)，是修復(fù)失牙、恢復(fù)咀嚼功能的有效方法之一。異體牙主要包括因移位、阻生、正畸等需要而拔除的正常牙，異體牙移植因其供體來源豐富而具有重要意義[2]。

異體牙移植同樣面臨的一個難題是移植后的排斥反應(yīng)。從Vasilchenko等[4-6]報道來看，動物異體牙移植實驗或臨床異體牙移植病例的成功率約有9.6%～83.0%。對于異體牙移植排異反應(yīng)的研究，國外學(xué)者大多采用非特異性檢測方法，主要有：①宿主對來自同一供體的“二次皮膚移植”的加速排斥反應(yīng)；②受植區(qū)域內(nèi)淋巴結(jié)中免疫淋巴母細胞的產(chǎn)生。以往的研究認為異體牙牙周膜組織所導(dǎo)致的移植免疫反應(yīng)是導(dǎo)致牙根吸收、影響移植牙存活率和存活時間的重要因素[7-8]。

目前人們常通過選擇和處理異體牙的組織相容性配型試驗來消除或降低異體牙移植的免疫排斥反應(yīng)。常用的決定受體組織配型方法是ABO血型相容性試驗、HLA分型試驗及組織相容性交叉試驗。Unno等[9]發(fā)現(xiàn)供受體組織相容性抗原一致的異體牙在移植后1年存活率為85.0%，而組織相容性抗原不同的異體牙移植后1年存活率只有31.0%。

近年來，學(xué)者們移植術(shù)后牙根吸收的并發(fā)癥問題進行深入研究。Nishimura等[10-11]通過未根管處理的異體牙移植比經(jīng)根管處理的組織學(xué)觀察，發(fā)生的牙根吸收程度進展快速。本研究結(jié)果，移植術(shù)后1周開始移植區(qū)根尖部位有根吸收陷窩出現(xiàn)，有破骨細胞與各種因子協(xié)同作用完成，對牙槽骨、牙周膜吸收起誘導(dǎo)作用。由于根吸收發(fā)生區(qū)域的不確定性和觀察部位沒有詳細定位，無法做定量的統(tǒng)計學(xué)分析，但從組織切片上可明顯觀察到這一趨勢。本實驗牙移植術(shù)后經(jīng)檢測ACMC和CMC反應(yīng)，各時間段觀察細胞殺傷率均為高，移植區(qū)比較有高度的顯著性差異（P＜0.01）。說明異體牙移植具有排斥反應(yīng)。異體牙的CMC在移植術(shù)后2周開始就呈現(xiàn)出殺傷水平，但異體牙的ACMC反應(yīng)移植術(shù)后4周開始明顯地高于異體牙供者。這說明：①牙根表面的牙周膜免疫抑制功能的Fas配體的存在性；②細胞免疫對異體牙有免疫排斥反應(yīng)；③實驗中采取的保存溶液、靶細胞、生物化學(xué)試劑及反應(yīng)試劑不能代表牙移植宿主體內(nèi)實際的免疫反應(yīng)水平；④異體牙移植具有排斥反應(yīng)。

異體牙來源豐富，如果找到消除異體牙移植術(shù)后并發(fā)癥的免疫排斥反應(yīng)，將提高異體牙移植術(shù)的成功率，有待今后深層的研究。

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[11]Schwartz O,Andreasen JO.Allo and autotransplantation of mature teeth in monkeys:a sequential time-related histoquantitative study of periodontal and pulpal healing[J].Dent Traumatol,2002,18(5):246-261.