人前列腺癌細(xì)胞特異性結(jié)合短肽在人體組織的分布

胡金秋,李 偉,張麗紅,張國(guó)榮,劉志晶,董欣潔,張玉輝,李一雷

(1.長(zhǎng)春醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校病理教研室,吉林長(zhǎng)春 130031;2.吉林大學(xué)病理生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,吉林長(zhǎng)春 130021）

前列腺癌(Carcinoma of Prostate,PC）是男性泌尿生殖系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤,在歐美等西方國(guó)家僅次于肺癌是男性第二大癌癥[1],在我國(guó)的發(fā)病率位居男性泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的第三位。遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是前列腺癌患者最主要的死亡原因。因此,從前列腺癌的侵襲、轉(zhuǎn)移方面作為切入點(diǎn)采用導(dǎo)向治療的方法著手研究前列腺癌的治療是未來(lái)人類戰(zhàn)勝前列腺癌的一個(gè)可能突破點(diǎn)。在前期研究中,利用噬菌體隨機(jī)七肽庫(kù)篩選得到一組與人前列腺癌細(xì)胞PC-3M特異性結(jié)合的前列腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)短肽[2-5],選取與共有序列最接近的特異性短肽,研究該結(jié)合短肽的配體蛋白在人體正常組織中的分布,為探索其在臨床抗前列腺癌導(dǎo)向治療中的應(yīng)用提供形態(tài)學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 石蠟標(biāo)本收集 收集2006年-2008年吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院尸檢及活檢標(biāo)本:尸檢石蠟標(biāo)本12例,組織塊53塊,包括臟器16種;前列腺組織活檢石蠟標(biāo)本11例。

1.1.2 主要試劑 PC-3M細(xì)胞來(lái)源于美國(guó)細(xì)胞庫(kù)(American Type Cuhure Collection,ATCC）;抗M13小鼠單隆抗體購(gòu)自瑞典Amersham公司,IMDM培養(yǎng)液購(gòu)自GIBCO公司;SP免疫組化試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)有限公司;胰蛋白酶購(gòu)自杰華科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 PC-3M細(xì)胞培養(yǎng)及爬片 將PC-3M細(xì)胞用含10%胎牛血清的IMDM培養(yǎng)液中傳代培養(yǎng),細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)以每孔2×104個(gè)細(xì)胞加入24孔板,每孔加500 μ l細(xì)胞懸液。繼續(xù)培養(yǎng)6小時(shí)后分別加入特異性結(jié)合短肽各1×1011pfu共培養(yǎng),分別以加入空載體和IMDM培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照。24小時(shí)后,細(xì)胞融合達(dá)80%,4%多聚甲醛固定。

1.2.2 擴(kuò)增特異性結(jié)合短肽并測(cè)定滴度 用待擴(kuò)增短肽感染大腸桿菌ER2738并擴(kuò)增,用PEG/NaCl在4℃沉淀噬菌體。用10倍系列稀釋的噬菌體接種好ER2738的LB/IPTG/Xgal平板,檢查計(jì)數(shù)有-102個(gè)噬菌斑的平板上的噬菌斑數(shù),再用此數(shù)目乘以稀釋因子即得到每10μ l噬菌體的空斑形成單位(pfu）滴度。

1.2.3 免疫組織化學(xué)方法進(jìn)行檢測(cè) 特異性短肽是表達(dá)在M-13噬菌體表面的,所以選用抗M-13噬菌體抗體作為檢測(cè)短肽與細(xì)胞結(jié)合的抗體。用PC-3M細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照,用PBS和空載體分別取代特異性短肽,用PBS取代抗M-13噬菌體抗體做陰性對(duì)照,對(duì)人體各組織標(biāo)本進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。前列腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白結(jié)合物是人前列腺癌PC-3M細(xì)胞膜蛋白的結(jié)合物,所以該短肽與待檢測(cè)組織細(xì)胞的結(jié)合均以細(xì)胞膜上出現(xiàn)黃色顆粒為判定陽(yáng)性的標(biāo)準(zhǔn),基本不著色定為陰性(-）,淡黃色定為弱陽(yáng)性(+）、黃色定為陽(yáng)性(++）、棕黃色定為強(qiáng)陽(yáng)性(+++）。本文結(jié)果所統(tǒng)計(jì)的陽(yáng)性率是以+-+++為陽(yáng)性計(jì)算。

2 結(jié)果

2.1 前列腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白結(jié)合物的配體蛋白在上皮組織的分布

2.1.1 前列腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白結(jié)合物的配體蛋白在腺上皮的分布 免疫組織化學(xué)半定量分析表明,前列腺癌侵襲相關(guān)蛋白結(jié)合物在胰腺的內(nèi)分泌部即胰島有配體蛋白能與之結(jié)合,12例標(biāo)本中陰性有6例,弱陽(yáng)性為2例,陽(yáng)性為4例,其陽(yáng)性率為50%。在胃底腺壁細(xì)胞上有配體蛋白與短肽結(jié)合,10例標(biāo)本中陰性為4例,表達(dá)為弱陽(yáng)性有2例,陽(yáng)性有4例,其陽(yáng)性率為60%。在腎上腺等其他腺體中未見(jiàn)有配體蛋白與之結(jié)合(表1,圖1、2）。

表1 前列腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白結(jié)合物的配體蛋白在腺上皮的分布

2.1.2 前列腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白結(jié)合物的配體蛋白在被覆上皮的分布 免疫組織化學(xué)半定量分析表明,前列腺癌侵襲相關(guān)蛋白結(jié)合物在各種被覆上皮中未見(jiàn)有配體蛋白與之結(jié)合(表2）。

2.2 前列腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白結(jié)合物的配體蛋白在結(jié)締組織和神經(jīng)組織的分布

免疫組織化學(xué)半定量分析表明,前列腺癌侵襲相關(guān)蛋白結(jié)合物在結(jié)締組織和神經(jīng)組織中未見(jiàn)有配體蛋白與之結(jié)合(表3）。

2.3 前列腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白結(jié)合物的配體蛋白在肌組織的分布

免疫組織化學(xué)半定量分析表明,前列腺癌侵襲相關(guān)蛋白結(jié)合物在肌組織中未見(jiàn)有配體蛋白與之結(jié)合(表4）。

圖1 前列腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白結(jié)合物的配體蛋白在胰腺上的分布

圖2 前列腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白結(jié)合物的配體蛋白在胃底腺上的分布

表2 前列腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白結(jié)合物的配體蛋白在被覆上皮的分布

表3 前列腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白結(jié)合物的配體蛋白在結(jié)締組織和神經(jīng)組織的分布

表4 前列腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白結(jié)合物的配體蛋白在肌組織的分布

2.4 前列腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白結(jié)合物的配體蛋白在前列腺增生的表達(dá)情況

免疫組織化學(xué)半定量分析表明,前列腺癌侵襲相關(guān)蛋白結(jié)合物在前列腺增生時(shí)未見(jiàn)有配體蛋白與之結(jié)合(表5）。

綜上結(jié)果顯示,檢測(cè)了人體腦、心、肝、腎、喉、氣管 、肺 、脾 、垂體 、腎上腺 、甲狀腺 、胸腺 、小腸 、胃 、胰腺、卵巢共16種器官,人前列腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的特異性結(jié)合短肽與被覆上皮、肌組織、神經(jīng)組織、結(jié)締組織無(wú)結(jié)合;與大多數(shù)腺上皮無(wú)結(jié)合;與人胃底腺壁細(xì)胞有親和性,配體蛋白表達(dá)的陽(yáng)性率為60%;與胰島細(xì)胞有親和性,配體蛋白表達(dá)的陽(yáng)性率為50%;在良性前列腺增生時(shí)無(wú)表達(dá)。

表5 前列腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白結(jié)合物的配體蛋白在前列腺增生的結(jié)合情況

3 討論

前列腺癌已經(jīng)成為男性泌尿生殖系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。雖然目前對(duì)前列腺癌有多種治療手段,如內(nèi)分泌治療、放療、化療和手術(shù)治療。但無(wú)論哪種治療方法對(duì)于發(fā)生了雄激素抵抗的患者都不能達(dá)到理想的治療要求[6],因而探討前列腺癌的治療方法是臨床上迫切需要的。

前列腺癌蛋白質(zhì)組學(xué)在國(guó)際上正在進(jìn)行,如前列腺腫瘤標(biāo)記物的尋找、前列腺癌的診斷、干預(yù)機(jī)制的研究等[7-9],努力尋找能夠特異性殺傷腫瘤細(xì)胞的抗腫瘤藥物是許多致力于腫瘤研究的學(xué)者所研究的熱點(diǎn)項(xiàng)目[10]。抗腫瘤導(dǎo)向治療的問(wèn)世更需要高效特異性載體,以實(shí)現(xiàn)抗腫瘤治療的高效能性和低損傷性。

結(jié)合前期進(jìn)行的前列腺癌特異性結(jié)合短肽方面系列研究[2-5],本實(shí)驗(yàn)觀察序列為CGWTPVI的特異性結(jié)合短肽的配體蛋白在人體正常組織中的分布情況,從而為該短肽在抗前列腺癌導(dǎo)向治療中的應(yīng)用提供形態(tài)學(xué)依據(jù)。掌握該短肽的配體蛋白在人體組織器官中的分布情況將使短肽有可能成為導(dǎo)向治療的更高效載體,使藥物在前列腺癌局部達(dá)到高濃度發(fā)揮作用,而不與人體正常組織細(xì)胞結(jié)合從而減少藥物的副作用。本實(shí)驗(yàn)還同時(shí)檢測(cè)該配體蛋白在前列腺增生時(shí)的表達(dá)情況,目的在于觀察在前列腺良性病變和惡性病變時(shí)蛋白表達(dá)的差異,以便進(jìn)一步分析此種蛋白表達(dá)差異對(duì)細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,探討腫瘤轉(zhuǎn)移的可能機(jī)制。

進(jìn)而,在前期系列研究基礎(chǔ)上,還可以通過(guò)釣取人前列腺癌PC-3M細(xì)胞膜上與特異性短肽相結(jié)合的配體,對(duì)其詳細(xì)信息和功能進(jìn)行分析,進(jìn)一步研究蛋白質(zhì)間相互作用。或者進(jìn)一步檢測(cè)該特異性短肽在各型前列腺癌和其它腫瘤細(xì)胞上是否有配體蛋白,探討該短肽是特異性存在于高轉(zhuǎn)移性前列腺癌細(xì)胞,還是多種高轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞所共有,從而有可能發(fā)現(xiàn)一種全新的腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白。進(jìn)一步探討與前列腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移有關(guān)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,為研究前列腺癌或者其他腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制提供線索。

總之,本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了前列腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)結(jié)合短肽的配體蛋白在人體組織、器官中的分布情況,并檢測(cè)了短肽在前列腺增生時(shí)配體蛋白表達(dá)情況,掌握了短肽的特異性,這為進(jìn)一步研究前列腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制提供了研究線索,為該短肽在前列腺癌的抗腫瘤導(dǎo)向治療中的應(yīng)用提供形態(tài)學(xué)依據(jù)。該短肽可與前列腺癌細(xì)胞表面特異性蛋白結(jié)合,而與大部分人體正常組織無(wú)結(jié)合,具有良好的特異性,證明該短肽具有臨床應(yīng)用的潛能,為針對(duì)前列腺癌的抗腫瘤導(dǎo)向治療中藥物載體的設(shè)計(jì)提供了基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

[1]Kurahashi N,Sasazuki S,Iwasaki M,Inoue M,Tsugane S.Green tea consumption and prostate cancer risk in Japanese men:A prospective study[J].American Journal of Epidemiology,167(1）,2008.71.

[2]李 群,李一雷,張 越,等.人前列腺癌PC-3M細(xì)胞中與轉(zhuǎn)移相關(guān)靶標(biāo)蛋白的篩選[J].中國(guó)老年學(xué)雜志,2008,28(1）:124.

[3]李 群,李一雷,牛 云,等.人前列腺癌PC-3細(xì)胞膜蛋白組學(xué)的分析[J].中國(guó)生物制品學(xué)雜志,2008,21(1）:33.

[4]李 群,李一雷,李貴榮,等.轉(zhuǎn)移潛能不同的人前列腺癌細(xì)胞系差異膜蛋白質(zhì)組學(xué)的分析[J].中華腫瘤防治雜志,2008,15(2）:118.

[5]夏 陽(yáng),李一雷,李 群,等.人前列腺癌細(xì)胞特異性結(jié)合短肽的篩選[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué),2007,11(2）:143.

[6]Pfitzenmaier J,Altwein JE.Hormonal therapy in the elderly prostate cancer patient[J].Dtsch Arztebl Int,2009,106(14）:242.

[7]Dutkowski J,Gambin A.On consensus biomarker selection.BMC Bioinformatics,2O07,8(Suppl 5）:S5.

[8]Wittke S,Schiffer E,BauerHW,et al.Capillary electrophoresis coupled to mass spectrometry for proteome analysis:An innovative diagnostic method for prostate and bladder cancer.Urologe,2007,46(7）:733-739.

[9]Goo YA,Young Ah,Li Z,et al.Systematic investigation of lycopene effects in LNCaP cells by use of novel large-scale proteomic analysis software,Pro Clin Appl,2007,1(5）:513-523.

[10]金光虎,陳 爽,楊 麗,等.羥基喜樹(shù)堿對(duì)人前列腺癌PC-3m細(xì)胞凋亡的影響[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué),2010,1:12.