慢性乙型肝病患者肝組織和血清CTGF的檢測及意義

張秀軍,高潤平,張瑞娟,朱 杰

(吉林大學第一醫院肝病內科,吉林長春 130021）

肝纖維化是以各種慢性致病因素作用于肝臟大量細胞外基質(extracellular matrix,ECM）在肝內合成和沉積為特征。在肝纖維化的發生和發展過程中,肝臟慢性炎癥反應導致肝星狀細胞(Hepatic stellate cell,HSC）激活,轉化為具有表達а-平滑肌動蛋白(а-SMA）、增殖活性的肌成纖維樣細胞,激活的HSC是肝臟ECM產生的主要細胞[1]。結締組織生長因子(connective tissue growth factor,CTGF/CCN2）是一種具有分泌特性的細胞基質蛋白,其與TGF-β1共同誘導肝纖維化的發生。CTGF是TGF-β1誘導大鼠HSC、胰星狀細胞、成骨細胞合成I型膠原的下游介導者[2-4]。近來Gressner等[5]報道慢性丙型肝炎和酒精型肝炎患者血清CTGF的升高可直接反應其肝纖維化的進展情況。本研究通過檢測慢性乙型肝病患者血清CTGF的水平,探討血清CTGF水平與肝組織CTGF表達及肝纖維化程度的相關性,以評價血清CTGF水平在慢性乙型肝病(CLD-B）患者肝纖維化診斷中的意義。

1 材料與方法

1.1 材料收集2008年10月至2009年6月在吉林大學第一醫院肝膽胰內科門診和住院CLD-B患者(血清HBsAg均為陽性）共155例,其中CHB 89例,男56例,女33例,平均年齡43.5±24.6歲;活動性肝硬化35例,男23例,女12例,平均年齡42.7±19.3歲;靜止性肝硬化31例,男21例,女10例,平均年齡45.2±20.8歲。肝硬化患者按Child-Puph分級,肝儲備功能A級46例,B級20例。對照組30例為健康者,從我院體檢中心募集,其中男18例,女12例,平均年齡33.3±13.6歲。

1.2 樣品采集與處理空腹采集所有患者及健康對照者靜脈血4 mL,留取血清凍存于-80℃冰箱備用。對其中31例肝臟活體穿刺標本經常規甲醛固定、石蠟包埋、切片、HE染色及Van Gieson氏膠原染色,進行肝組織炎癥分級和纖維化分期。

1.2.1 血清CTGF檢測 ELISA法檢測人血清CTGF,試劑盒購自美國ADL。操作流程按說明書進行,使用Bio-Rad 550酶標儀(USA）在波長450 nm測得OD值,根據樣品OD值及標準曲線計算待測樣品的濃度。

1.2.2 肝組織CTGF mRNA檢測 采用多項寡核苷酸探針和高敏感標記技術檢測人肝組織CTGF mRNA,試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。操作步驟參見試劑盒說明書。采用AEC顯色,胞漿出現紅色顆粒為陽性細胞,蘇木素復染,水性封膠封片。采用計算機圖像分析系統Image-Pro Plus 6.0,對每張切片隨機取10個400×視野,掃描CTGF mRNA陽性細胞,計算其平均積分光密度值(integrated optical density,IOD）。

1.2.3 免疫組化染色檢測肝組織α-SMA UltraSensitiveTM S-P超敏試劑盒購自福州邁新生物技術開發有限公司,鼠抗人α-SMA單克隆抗體為北京中杉金橋生物技術有限公司產品。肝組織α-SMA檢測按試劑盒說明書進行。DAB顯色,蘇木素復染。陰性對照用PBS緩沖液代替一抗。

1.2.4 統計學處理

統計學分析采用SPSS17.0統計軟件進行,血清CTGF水平用±s表示,兩樣本均數比較用t檢驗;Spearman法進行相關性分析。P＜0.05為差異有顯著性意義。

2 結果

2.1 CTGF mRNA在肝組織的表達

CHB肝小葉內竇周間隙可見α-SMA表達陽性的激活HSC(圖1A）,激活的HSC是表達CTGF mRNA的主要細胞(圖1B）。CTGF mRNA陽性的細胞在LC纖維化條帶內部及周邊被檢出(圖1C）,與膠原纖維分布一致(圖1D）。

2.2 血清CTGF的測定結果

慢性乙型肝炎、活動性肝硬化患者血清CTGF水平明顯高于正常對照組(P＜0.01）,靜止性肝硬化患者血清CTGF水平亦高于正常對照組(P＜0.05）。活動性肝硬化和慢性乙型肝炎患者血清CTGF水平之間比較差異無顯著性(表1）。

圖1 CHB組織病理學

表1 CLD-B患者及健康對照者血清CTGF測定結果(±s）

表1 CLD-B患者及健康對照者血清CTGF測定結果(±s）

注:與對照組比較,*P＜0.01,△P＜0.05

組別 n CTGF(μ g/L）對照組 30 2.21±0.42慢性乙型肝炎 89 9.15±3.35*活動性肝硬化 35 9.73±3.60*靜止性肝硬化 31 5.42±2.56△

2.3 CTGF與肝纖維化分期及炎癥分級的關系

CLD-B患者肝纖維化程度越重肝組織CTGF mRNA表達越強,血清CTGF水平越高,Spearman相關分析顯示CLD-B患者血清CTGF水平與肝組織CTGF mRNA表達及纖維化的程度呈正相關關系(r=724,r=0.549,均為P＜0.05）。(表2）

CLD-B患者血清CTGF水平與肝組織炎癥程度無相關性(P＜0.05）。

表2 CLD患者血清和肝組織CTGF水平與肝纖維化分期的關系(±s）

表2 CLD患者血清和肝組織CTGF水平與肝纖維化分期的關系(±s）

纖維化分期 n CTGF(μ g/L） CTGF mRNA(IOD）S0 4 2.35±0.46 8.18±4.23 S1 4 4.27±1.63 19.54±9.46 S2 8 5.74±1.67 24.71±12.13 S3 7 7.26±1.83 32.36±15.35≥S4 8 8.56±1.78 38.76±18.41

3 討論

慢性乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV）感染是肝纖維化、肝硬化甚至肝癌的主要原因[6]。Martín-Vílchez S等通過體外細胞聯合培養的研究證實:肝細胞通過表達和分泌HBV X蛋白(HBx）刺激人HSC激活和增殖,使 CTGF和 I型膠原合成增加[7]。近來,Liu Xuan等采用HepG2.2.15培養上清刺激人肝星狀細胞株(LX-2）,結果顯示:HBV可短暫感染LX-2細胞,并直接刺激LX-2增殖,使I型膠原的合成明顯增加[8],這些研究為HBV致肝纖維化提供了直接的實驗依據。我們先前的研究表明:靶向CTGF的錘頭核酶通過阻斷內源性CTGF的合成,有效抑制基礎和TGF-β1誘導的人HSC合成I型膠原和細胞向S期轉化[9],說明CTGF在HSC介導肝纖維化發生學起著重要的作用。本研究發現CHB患者肝組織竇周間隙激活的HSC表達CTGF mRNA,CTGF mRNA陽性的細胞可在LC纖維化條帶內部及周邊檢出,且與膠原纖維分布具有良好的一致性,這就從組織病理學進一步說明CTGF在HSC介導慢性HBV感染所致肝纖維化發生學的作用。

在過去的5-10年中,其他來源的纖維原性細胞亦在肝纖維化病灶中檢出,包括骨髓源性纖維細胞、門管區纖維原細胞及由肝細胞和膽管細胞通過上皮間質轉化形成的肌成纖維樣細胞[10-12],這些細胞在不同原因所致肝纖維化發生學發揮相應的作用,并受制于相應疾病進程[13]。既往普遍認為定居于肝小葉竇周間隙的HSC在慢性乙、丙型肝炎患者肝纖維化發生學起著重用的作用,本研究發現CHB門管區炎癥部位有CTGF mRNA表達陽性的纖維原細胞,其有可能參與CTGF介導的慢性HBV感染所致肝纖維化的發生學。

CTGF是一種分泌型基質蛋白,其與TGF-β1共同承擔肝纖維化發生的功能。本研究表明:CLD-B患者血清CTGF水平與肝纖維化程度呈正相關,進一步提示血清CTGF可作為CLD-B患者反映進展性肝纖維化的一種血清標志。

目前,在世界范圍內普遍將肝活檢組織病理學作為診斷肝纖維化的“金標準”[15]。然而肝活檢存在創傷性,取樣誤差,加上病理觀察者的變異等缺點,而影響肝纖維化診斷的準確性。近年來通過檢測血清HA、LN、C IV,來評價在肝纖維化診斷方面的價值,但特異性和敏感性并不理想。本研究通過檢測CLD-B患者血清和肝組織CTGF水平,評價其與肝組織纖維化分期及炎癥分級的關系,結果表明:血清CTGF的升高水平與肝組織CTGF mRNA表達強度及肝纖維化程度呈正相關關系,而與肝組織炎癥程度無關。因此認為,檢測血清CTGF對診斷CLD-B患者肝纖維化具有實際臨床意義。

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