6-巰基嘌呤致嚴重骨髓抑制的遺傳分析

王,郭穎杰,周 慧,李春懷*

(1.吉林大學第一醫院、吉林大學兒童血液病診治中心,吉林長春 130021;2.吉林大學生命科學院）

文獻報道6-MP的療效和毒性與其代謝過程相關酶的基因多態性相關[1],TPMT是6-MP代謝過程的關鍵酶之一,能特異地催化6-MP甲基化而失活,從而影響其主要活性代謝產物TGNs的形成。為了研究患兒應用6-巰基嘌呤產生嚴重骨髓抑制的原因,我們對參與 6-MP代謝的巰嘌呤甲基轉移酶(TPMT）基因進行了測序和TPMT酶活力測定。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

患兒,女,3歲,確診急性淋巴細胞白血病(B細胞型）。按全國小兒白血病協作組化療方案化療,誘導緩解化療達完全緩解,序貫治療進入維持治療,應用6-巰基嘌呤(50-75mg/m2/天）實予37.5 mg/天,晚睡前頓服,共21天;甲氨喋呤(20-40 mg/m2/次）實予12.5 mg/次,每周1次共3次。第1次維持用藥應用6-巰基嘌呤即37.5 mg/天晚睡前頓服10天后外周血常規下降明顯,出現IV級骨髓的抑制,外周血WBC 0.7×109/L;RBC 1.62×1012;Hb 47 g/L;PLT 7×109。停用6-巰基嘌呤后,血常規恢復正常。第2次維持用藥將6-巰基嘌呤每天的劑量減至7mg維持用藥后,骨髓的抑制程度減輕,外周血常規WBC 2.1×109/L;RBC 2.62×1012;Hb 77 g/L;PLT 91×109。以上臨床資料表明,此患者應用常規劑量的6-MP后出現嚴重的骨髓抑制,將劑量減至原來的1/5以上,仍有比較明顯的骨髓抑制。

1.2 試劑

全血基因組DNA純化試劑盒購自華美公司;Taq DNA聚合酶、dNTP購自寶生物工程大連有限公司;各種引物的定購和測序都有上海生工生物技術服務有限公司完成;S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM）、6-甲基-巰基嘌呤(6-MMP）、別嘌醇(Allopurinol）均購自Sigma公司。

1.3 全血DNA的抽提

取患者冷凍保存的肝素抗凝血1ml,用全血基因組DNA純化試劑盒從中提取全基因組DNA,于-20℃保存。

1.4 TPMT基因的全測序

TPMT基因位于染色體6p 22.3上,全長為34 kb,包括10個外顯子和9個內含子。具體步驟以全基因組DNA為模板1 μ l,分別加入dNTP(10 mmol/L）1 μ l、10×buffer 5 μ l、加入上下游引物 20 pmol(表1）各 0.75 μ l,Taq E 0.5 μ l,補充三蒸水至終體積為50 μ l,混勻。PCR條件為:變性94 ℃45 s,引物各自的退火溫度40 s,延伸72℃30 s,循環35輪。擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測,并委托上海生物工程有限公司對其進行測序。表1列舉了用PCR法擴增TPMT各外顯子的引物序列,引物位置和擴增片斷的大小。

1.5 TPMT酶活的測定

TPMT酶活性測定方法:以S-腺苷-L-甲硫氨酸為特異性的甲基供體,催化6-巰基嘌呤生成6-甲基-巰基嘌呤。

將新鮮全血放于15ml離心管中800 g,4℃離心15 min,紅細胞沉淀用0.9%冰冷生理鹽水洗三次(800 g,4℃離心15 min）,加入等體積冷水于4℃裂解20 min,12 000 g、4℃離心1 0min,吸取上清凍存于-80℃保存。取3 ml紅細胞裂解液,慢慢融化,加入1/10體積的chelex100,移走Mg2+離子,在4℃輕搖 1小時,2 800 g在4℃離心5分鐘,吸取上清液。在上清液1 ml中分別加入253 μ l、150 mM磷酸鉀緩沖液(pH7.5）、終濃度 1 mM DTT 、58 μ M 別嘌醇 、29 μ M SAM和7.2 mM 6-巰基嘌呤至總體積1.5 ml,在37℃水浴搖1.5小時,直接凍存于-80℃中止反應。在0.75 ml上述反應液中加入0.875 ml(Methanol:0.1N HCl）,于4℃5 000 g離心 5 min,重復一次。用0.45 μ M或0.22 μ M 的水膜過濾樣品,進行HPLC檢測。色譜柱為SB-300A C18(安捷倫公司生產）。洗脫條件為流動相:A:甲醇;B:水,用醋酸調pH值至2.9,流速:A:0.12 ml/min;B:0.79 ml/min,在290 nm有UV吸收。該方法的標準曲線線性范圍為25～2 000 μ g?L-1(r＞0.998）。

表1 用于TPMT測序的引物的序列和位置

2 結果

2.1 TPMT基因的全測序的結果

根據NCBI中TPMT的基因序列(NC-000006）,采用內含子特異性結合的引物,擴增TPMT基因的每個外顯子及外顯子和內含子連接部位。測序的結果表明TPMT基因序列中存在三處突變(如圖1所示）,包括內含子4的C7355T;內含子5的T 11606C;外顯子7的C16161T無意義突變。

圖1 TPMT基因的核苷酸順序。A為內含子4的C7355T突變;B為內含子5的 T 11606C突變;C為外顯子7的C16161T無意義突變。

2.2 TPMT酶活力的測定結果

為了驗證患者TPMT基因序列中的兩處內含子突變是否影響TPMT基因的剪切,從而影響轉錄,蛋白含量和酶的活力,我們通過HPLC方法測定患者新鮮血液中TPMT酶活力。如圖2所示6-MP和 6-MMP的出峰時間分別13 min和34 min。通過標準曲線求算得到TPMT酶活力為15 nmol/h/ml PRBC,屬于TPMT高活性者。

圖2 通過HPLC方法檢測6-MP的代謝產物6-MMP含量

3 討論

6-MP是治療兒童急性淋巴細胞白血病最為廣泛的藥物之一。其主要作用機制是6-巰基嘌呤在細胞內通過合成代謝轉化為一系列6-硫鳥嘌呤核苷(6-thioguanine nucleotides,TGNs）的代謝產物,TGNs作為鳥嘌呤核苷的拮抗劑參入DNA和RNA分子,進而通過抑制DNA的復制和RNA的表達而發揮細胞毒作用。6-MP常與甲氨喋呤,長春新堿和強的松一起作為緩解ALL后的維持治療藥物,其中6-MP有不同程度的骨髓抑制,但是絕大多數患兒調整藥量后基本可以耐受不良反應,而同時間應用的小劑量甲氨喋呤口服對骨髓抑制作用不明顯。

本例ALL患兒在化療過程中服用常規劑量的6-MP出現了IV級的骨髓抑制,劑量下降至原來的1/5恢復正常,表明這是一名6-MP不耐受患者。文獻報道[1]6-MP的療效和毒性與其代謝過程相關酶TPMT的基因多態性相關。對于TPMT基因突變導致酶缺陷的病人,使用常規劑量的6-MP,也會導致體內巰基鳥嘌呤磷酸鹽的積累,產生嚴重的毒性,如嚴重的骨髓抑制和肝損害等,最終導致治療的被迫中斷,造成治療失敗[2,3]。常見的TPMT基因突變包括第5外顯子G238C、第7外顯子G469A和第10外顯子A719G,它們的突變均與酶活性減低有關。

為了探究6-MP導致此患者骨髓抑制的原因是否與TPMT基因突變有關,我們對這名患者TPMT基因進行了全測序。測序的結果表明TPMT基因序列中存在三處突變,包括內含子兩處和一處外顯子無意義突變。為了闡明內含子突變是否影響患者的酶活力,我們通過高效液相色譜法檢測紅細胞中TPMT活性。文獻[4]報道高活性的TPMT的酶活為10-25 nmol/h/ml packed red blood cells(PRBC）,中低活性TPMT的酶活為＜10nmol/h/ml PRBC。我們的結果顯示這名6-MP不耐受患者的TPMT活性為15nmol/h/ml PRBC,屬于TPMT高活性者,這與TPMT測序結果中未發現外顯子的有意義突變相一致,也說明內含子的突變不影響TPMT的酶活力,其骨髓抑制與TPMT酶缺陷無關。

以上研究結果表明這名6-MP不耐受者與TPMT的基因多態性無關,說明TPMT的基因多態性不能完全解釋6-MP的毒性作用,由于內外環境因素都可能影響機體對藥物的敏感性,機體對藥物反應的差異還需要多因素的共同分析。

[1]Palmieri O,Latiano A,Bossa F et al.Sequential evaluation of thiopurine methyltransferase,inosine triphosphate pyrophosphatase,and HPRT1 genes polymorphisms to explain thiopurines'toxicity and efficacy[J].Aliment Pharmacol Ther,2007,26(5）:737.

[2]Relling MV,Hancock ML,Boyett JM et al.Prognostic importance of 6-mercaptopurine dose intensity in acute lymphoblastic leukemia[J].Blood,1999,93(9）:2817.

[3]McLeod HL,Relling MV,Liu Q et al.Polymorphic thiopurine methyltransferase in erythrocytes is indicative of activity in leukemic blasts from children with acute lymphoblastic leukemia[J].Blood,1995,85(7）:1897.

[4]Nishida A,Kubota T,Yamada Y et al.Thiopurine S-methyltransferase activity in Japanese subjects:metabolic activity of 6-mercaptopurine 6-methylation in different TPMT genotypes[J].Clin Chim Acta,2002,323(1-2）:147.