酶聯(lián)免疫吸附法檢測抗肝素/血小板因子4復(fù)合物抗體的臨床意義

高亞玥 ，趙永強 ，王書杰 ?

（1．中日友好醫(yī)院 血液科，北京 100029；2．北京協(xié)和醫(yī)院 血液科，北京 100730）

酶聯(lián)免疫吸附法檢測抗肝素/血小板因子4復(fù)合物抗體的臨床意義

高亞玥1，趙永強2，王書杰2?

（1．中日友好醫(yī)院 血液科，北京 100029；2．北京協(xié)和醫(yī)院 血液科，北京 100730）

目的：評價酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測抗肝素/血小板因子4復(fù)合物抗體對臨床診斷肝素誘導(dǎo)的血小板減少癥（HIT）的敏感性及特異性。方法：選取應(yīng)用肝素制劑患者197例（男120例、女77例），ELISA法進行HIT抗體檢測，并根據(jù)臨床4Ts評分法分析其敏感性和特異性。結(jié)果：臨床診斷HIT患者6例，ELISA法檢測HIT抗體對診斷HIT的敏感性為83.3%，特異性為90.0%，陽性預(yù)測值為20.8%，陰性預(yù)測值為99.4%。結(jié)論：4Ts評分系統(tǒng)仍是目前臨床診斷HIT的重要依據(jù)，HIT抗體的檢測對HIT診斷的敏感性及特異性較好、可用于輔助診斷HIT。

肝素誘導(dǎo)的血小板減少癥；酶聯(lián)免疫吸附法；抗肝素/血小板因子4復(fù)合物抗體

Author’s addressDepartment of Hemology，China-Japan Friendship Hospital，Beijing 100029，China

肝素誘導(dǎo)的血小板減少癥 （heparin-induced thrombocytopenia，HIT）是指應(yīng)用肝素制劑期間或之后出現(xiàn)血小板計數(shù)的減少。應(yīng)用肝素制劑后血小板被激活，釋放出血小板因子4（PF4），形成肝素/PF4復(fù)合物，激活免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗肝素/血小板因子4復(fù)合物抗體，即HIT抗體 （anti-heparin/platelet factor 4 complex antibodies，HIT-antibody），從而進一步激活血小板，引起血小板聚集，導(dǎo)致血小板減少和繼發(fā)血栓形成。目前對HIT的臨床診斷主要依據(jù)4Ts評分系統(tǒng)。HIT抗體的實驗室檢測方法主要有肝素誘導(dǎo)的血小板聚集試驗（HIPA）、14C-血清素釋放試驗（SRA）和酶聯(lián)免疫吸附測定 （enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）。SRA試驗的敏感性和特異性較高，被認(rèn)為是診斷HIT的金標(biāo)準(zhǔn)，但技術(shù)要求高、具有放射性，僅能在少數(shù)有條件的實驗室完成。ELISA法操作相對簡單、應(yīng)用較廣，但各家試劑標(biāo)準(zhǔn)尚不統(tǒng)一，已有報道的敏感性和特異性存在較大差異。我國目前尚無關(guān)于ELISA法檢測HIT抗體對HIT診斷價值的相關(guān)研究。

本研究中，我們對肝素制劑治療的患者應(yīng)用ELISA方法測定HIT抗體，對其診斷HIT的敏感性和特異性進行研究。

1 對象和方法

1.1 研究對象

選取2008年11月～2009年5月間，在中日友好醫(yī)院和北京協(xié)和醫(yī)院住院并接受普通肝素（unfractionated heparin，UFH） 或低分子量肝素（low molecular weight heparin，LMWH）治療的患者共197例，其中男120例、女77例，平均年齡64歲。選取門診健康體檢者30例做為空白對照，其中男18例、女12例，既往無肝素制劑應(yīng)用史。

1.2 方法

健康體檢者及患者應(yīng)用UFH或LMWH之前，檢測血小板計數(shù)、肝腎功能、凝血功能等。患者應(yīng)用UFH或LMWH之后每周檢測血小板計數(shù)2～3次，凝血功能、肝腎功能1～2次。健康體檢者在體檢當(dāng)天、入選患者在應(yīng)用肝素制劑后第5～7d（平均6.5d），用血清分離管采集靜脈血4ml，于室溫放置2h后以1000g離心20min，提取上清液分裝，置于-80℃冰箱內(nèi)保存、以備HIT抗體檢測。

應(yīng)用USCNLIFE-武漢中美科技有限公司生產(chǎn)的HIT抗體 （即人抗肝素/PF4復(fù)合物抗體）ELISA試劑盒檢測HIT抗體，具體步驟參照廠商說明書。結(jié)果判讀：以健康體檢者HIT抗體檢測平均值±2個標(biāo)準(zhǔn)差為閾值，小于此值為陰性，大于此值為陽性，本研究30例健康體檢者HIT抗體檢測平均值為4.66U/L，標(biāo)準(zhǔn)差為1.25U/L，定義：HIT抗體＞7.16U/L為陽性，＜2.16U/L為陰性。

根據(jù)Warkentin等建議的4Ts評分系統(tǒng) （見表1），即應(yīng)用肝素制劑后出現(xiàn)血小板減少的時間、程度、有無新發(fā)血栓及能否除外其他引起血小板減少的原因這四個方面，對每例患者進行4Ts評分，高可能性 （6～8 分）， 中可能性 （4～5 分），低可能性 （0～3分）1，評分為6-8分的高可能性患者臨床診斷為HIT。

1.3 統(tǒng)計指標(biāo)及方法

統(tǒng)計臨床診斷HIT的例數(shù)及ELISA法檢測出HIT抗體陽性的例數(shù)，評價ELISA法檢測HIT抗體對臨床診斷HIT的敏感性和特異性。敏感性：患病發(fā)現(xiàn)的能力，即陽性檢測的樣本占患病總數(shù)的百分比；特異性：無病發(fā)現(xiàn)的能力，即陰性檢測的樣本占無病總數(shù)的百分比；陽性預(yù)測值（PPV）：在陽性檢測的樣本總數(shù)中，患病樣本占陽性檢測樣本總數(shù)的百分比；陰性預(yù)測值（NPV）：在陰性檢測的樣本總數(shù)中，無病樣本占陰性檢測樣本總數(shù)的百分比。

2 結(jié)果

2.1 臨床診斷HIT

197例患者中，臨床診斷HIT（4Ts評分高可能性）共6例，包括表2中的1～5例，還有 1例HIT抗體檢測陰性患者，其診斷為系統(tǒng)性硬化癥、深靜脈血栓癥，應(yīng)用LMWH后d10出現(xiàn)血小板減少，低至27×109/L，有新發(fā)血栓形成，其4Ts評分為6分。

2.2 HIT抗體陽性患者的臨床特點

197例患者中，HIT抗體檢測陽性24例、陽性率12.2%，其中臨床診斷HIT 5例、非HIT 19例。非HIT患者中出現(xiàn)血小板減少癥2例，均為輕度、一過性減少，未停用肝素制劑很快恢復(fù)正常，原因可能為Ⅰ型HIT；其余17例既無血小板減少、也無新發(fā)血栓形成，4Ts評分均為0分。

2.3 HIT抗體測定對HIT診斷的敏感性與特異性

據(jù)表3計算可得出，ELISA法檢測HIT抗體對診斷HIT的敏感性為83.3%，特異性為90.0%，陽性預(yù)測值（PPV）為20.8%，陰性預(yù)測值（NPV）為99.4%。

表1 HIT臨床診斷的“4Ts”預(yù)測評分系統(tǒng)

表2 24例HIT抗體陽性患者臨床資料

3 討論

目前，對ELISA法檢測HIT抗體尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，試劑盒也存在國內(nèi)、外多個不同廠家，有定量及定性兩種，還有特異性檢測IgG型抗體的試劑盒。不同實驗室報道的HIT抗體檢測結(jié)果亦不甚相同，國內(nèi)尚無大宗報道，國外幾項較大樣本的研究結(jié)果顯示，ELISA法檢測HIT抗體的敏感性93%～100%、特異性 48.7%～81.7%[2～4]，綜合多數(shù)報道來看，ELISA法檢測HIT抗體對診斷HIT具有較高的敏感性（＞90%）和中等程度的特異性（50%～90%）[1]。本此研究的敏感性（83.3%）及特異性為（90.0%）尚可，但 PPV 較低（20.8%）。

表3 臨床診斷HIT與HIT抗體檢測結(jié)果 n

HIT抗體檢測的特異性及PPV偏低的原因有以下幾個方面：檢測出的抗體為一過性、非致病性的 IgA 和 IgM 型抗體[3，4]；或為隱性 HIT（有 HIT抗體產(chǎn)生，但無血小板減少）及孤立性HIT（有HIT抗體產(chǎn)生及血小板減少，但無血栓形成）5；采用以健康人群檢測結(jié)果的平均值±2個標(biāo)準(zhǔn)差做為閾值，故存在一定的局限性。今后需擴大臨床試驗，健康人群數(shù)量，并與金標(biāo)準(zhǔn)14 C-血清素釋放試驗進行比較驗證。

有3種情況可能導(dǎo)致HIT抗體檢測出現(xiàn)假陽性[6～8]：正常人體內(nèi)存在許多硫酸多糖類物質(zhì)可替代肝素與PF4結(jié)合，引起PF4抗原性改變，產(chǎn)生針對PF4的抗體；試劑盒自身包被的抗原不純，可與正常人血清中的免疫球蛋白物質(zhì)產(chǎn)生免疫反應(yīng)；或包被的抗原與正常人血清中的其他蛋白產(chǎn)生交叉反應(yīng)。人體內(nèi)一些非PF4的物質(zhì)，如白介素-8（IL-8）和中性粒細(xì)胞激活肽-2（NAP-2），可與肝素制劑結(jié)合引起HIT的發(fā)生，此種情況下不能檢測出HIT抗體，導(dǎo)致出現(xiàn)假陰性結(jié)果。

研究顯示，4Ts評分低分值具有較高的NPV（98.4%～100%），而4Ts評分高分值具有較高的PPV（100%）[6，9]。 因此，4Ts評分系統(tǒng)仍是目前診斷HIT的重要依據(jù)。理論上，聯(lián)合臨床4Ts評分和實驗室檢查可提高HIT診斷的準(zhǔn)確性。結(jié)合本研究和文獻報道我們認(rèn)為，若患者4Ts評分為低、中可能性，同時抗體陰性時可基本除外HIT；若4Ts評分為高可能性，同時抗體陽性時可基本診斷HIT；若4Ts評分為低、中可能性，而抗體陽性，需進一步檢測抗體類型以除外非致病性IgA或IgM型抗體，若為特異性IgG抗體則考慮為隱性或孤立性HIT，或可進行SRA、HIPA等實驗加以證實；因ELISA存在一定的假陰性結(jié)果、敏感性不能達100%，若4Ts評分為高可能性、但抗體陰性，可進行SRA、HIPA等實驗進一步確證。若無法開展SRA、HIPA等功能檢測，可重復(fù)ELISA法檢測HIT抗體，最好檢測特異性IgG型抗體。

綜上所述，4Ts評分系統(tǒng)仍是目前臨床診斷HIT的重要依據(jù)，ELISA法檢測HIT抗體敏感性及特異性尚可，可以輔助用于臨床診斷，聯(lián)合4Ts評分和HIT抗體檢測可提高確診和除外HIT診斷的準(zhǔn)確性。

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Detection and evaluation of heparin-induced thrombocytopenia antibody in patients treated with hep-arin preparations

GAO Ya-yue，ZHAO Yong-qiang，WANG Shu-jie//Journal of China-Japan Friendship Hospital，2011 Dec，25（6）：331－333

Objective：To evaluate the clincial value of heparin-induced thrombocytopenia antibody （HIT-antibody）detected by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）in the diagnosis of heparin-induced thrombocytopenia （HIT）.Methods：A total of 197 consecutive patients，including 120 males and 77 females，who were treated with heparin preparations，were enrolled in our study.HIT-antibody was detected by ELISA kits，and HIT was diagnosed based on “4Ts” Pretest Clinical Scoring System.The sensitivity and specificity of HIT-antibody assay for the diagnosis of HIT were analyzed.Results：Six patients were clinically diagnosed as HIT.HIT antibody assay had a sensitivity of 83.3%and a specificity of 90.0%，and its positive predictive value was 20.8%and negative predictive value was 99.4%in the diagnosis of HIT.Conclusion：“4Ts” scoring system is still the most important criterion for the diagnosis of HIT at present.The ELISA HIT antibody assay showed a certain satisfactory sensitivity and specificity and could be used to assist the diagnosis of HIT.

heparin-induced thrombocytopenia；enzyme-linked immunosorbent assay；anti-heparin/platelet factor 4 complex antibodies

R558+.2，R446.61

A

1001-0025（2011）06-0331-03

10.3969/j.issn.1001-0025.2011.06.003

2*本文通訊作者。

高亞玥（1978-），女，住院醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士。

2011-09-14

2011-10-19