安徽三界地區嚙齒動物感染恙蟲病東方體調查*

操 敏,王忠燦,陸年紅,黃華東,郭恒彬,王長軍,張 興,唐家琪

2.解放軍73046部隊衛生隊,三界 239421

安徽三界地區嚙齒動物感染恙蟲病東方體調查*

操 敏1,王忠燦1,陸年紅1,黃華東2,郭恒彬1,王長軍1,張 興1,唐家琪1

目的調查安徽三界地區嚙齒動物自然感染恙蟲病東方體分離株,并確定其基因型別。方法流行季節在野外用鼠籠捕鼠并鑒定鼠種、攜螨率;巢式PCR對鼠臟器進行恙蟲病東方體56 kD基因片段檢測;將鼠臟器接種小白鼠進行病原體分離,PCR擴增分離株Ot 56 kD基因片段,并將目的片段進行測序,基因序列同源性及進化分析。結果捕獲嚙齒動物數及其攜螨率,黑線姬鼠60%(15/25);褐家鼠45.5%(5/11);東方田鼠和鼩鼱各2只,均陰性。40只野鼠臟器有 3只恙蟲病東方體PCR擴增陽性,陽性率為7.5%;從黑線姬鼠標本中分離到1株恙蟲病東方體Sanjie,56 kD基因片段測定該株與臺灣TT0711a和N T0511b分離株同源性最高(98%),系統發生樹分析也顯示與Kawasaki型共處于同一分支。結論安徽三界地區存在鼠類恙蟲病東方體自然感染,黑線姬鼠為其主要宿主,當地恙蟲病東方體屬Kawasaki基因型。

恙蟲病東方體;嚙齒動物;病原分離;分子流行病學

三界地區位于安徽省東北部邊緣,地處江淮分水嶺地帶,屬低山丘陵地形。2007年11月當地駐軍某部發生一起恙蟲病暴發流行[1],僅1個連隊1 w內就出現19例臨床癥狀典型的恙蟲病病例。嚴重威脅著廣大指戰員及駐地群眾的健康。當地之前無恙蟲病病例及流行報告,特對三界地區嚙齒動物自然感染恙蟲病進行調查,并鑒定病原體分離株的基因型別,為防治提供依據。

1 材料與方法

1.1 地理、氣候、植被等項調查 對氣象局、環保局、林業局等機關的資料及縣志進行查詢與現場查看相結合。

1.2 宿主動物的調查 自2009年10～11月在三界地區不同景觀如房舍旁、菜地、花生地、草叢、田埂邊等鼠類較多區域布鼠籠捕鼠,黃昏放置晨起收回,鑒定鼠種,確定優勢鼠種,無菌操作取肝、脾、腎臟。收集體表寄生物,計算鼠攜螨率。

1.3 巢式PCR法檢測鼠臟器標本恙蟲病東方體DNA 使用INVITROGEN DNA提取試劑盒提取鼠臟器DNA作為模板,引物設計針對恙蟲病東方體56 kD主要表面抗原基因,巢式PCR檢測可提高檢測靈敏度和特異性。第一輪PCR反應引物 P1:5′-TACAT TAGCTGCGGGTA TGACA-3＇,P2:5′-CCAGCATAATTCT TCAACCAAG-3＇,預計擴增約340bp基因片段;第二輪 PCR反應引物P3:5′-TAGAGCAGAGCTAGGTGTTA TGTA-3＇,P4:5′-TAGGCAT TATAGTAGGCTGAGG-3＇,預計擴增約 180bp基因片段。反應程序為 95℃變性 5 min,94℃ 1 min,50℃ 1 min,72℃1 min,35個循環,72℃7 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,PCR試劑盒購置TAKARA公司。

1.4 恙蟲病東方體的分離與鑒定

1.4.1 恙蟲病東方體的分離 2009年10～11月從三界地區野外草叢、花生地、田埂等生境捕鼠,無菌操作取肝、脾、腎臟按同日同生境同種鼠2～6只為1份,共7份,包括黑線姬鼠3份,褐家鼠2份,東方田鼠和鼩鼱各1份。以上標本分別添加SPG蔗糖磷酸緩沖液,制成10%懸液,經腹腔接種15～18g昆明種小白鼠4只/組,0.5mL/只,每天觀察2次。陰、陽性判定標準見文獻[2]。判定為分離恙蟲病東方體陽性的小白鼠,無菌取肝、脾、腎置-30℃,保存備用。

1.4.2 PCR鑒定 按常規方法從恙蟲病東方體陽性感染的小白鼠臟器中提取DNA作為模板。用上述巢式PCR鑒定,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4.3 序列測定及分析 將擴增的基因片段送至TAKARA公司測序。同時遞交GENBANK獲序列號為:JF04210。測得的序列BLAST,用Bioedit軟件將序列長度編輯一致并進行格式轉換后,用clustal X軟件與各參考株序列進行多重排列、比較和同源性分析,軟件Mega 4.0中Distances程序計算一組序列內及組間基因進化距離(Evolutionary distances),利用最短進化長度算法(minimal evolution)進行系統進化樹分析。

2 結 果

2.1 丘陵平原地形 三界地區位于安徽省東北部邊緣,地處江淮分水嶺丘陵地帶,屬低山丘陵地形,北緯32°47′,東經117°58′。屬于北亞熱帶與溫暖帶過渡地帶的半濕潤氣候,年平均氣溫15℃,無霜期219 d,十分適宜花生、山芋等作物種植。其它種植作物主要有水稻、小麥、油菜、芝麻、玉米、小煙等。植被較豐富,適于恙螨、嚙齒動物等孳生。

2.2 鼠類宿主及其攜螨率 2009年10～11月在三界地區捕獲嚙齒動物40只,包括黑線姬鼠25只,褐家鼠11只,東方田鼠2只,鼩鼱2只,以黑線姬鼠為優勢鼠種,占62.5%。黑線姬鼠,褐家鼠,攜螨率分別是60%(15/25)、45.5%(5/11)。東方田鼠,鼩鼱均陰性。

2.3 分子流行病學檢測 套式PCR法檢測40只野鼠,結果從3只黑線姬鼠體內擴增出約200 bp基因片段,見圖1。a,b,c,與預計目的基因片段大小相符。PCR擴增陽性率為7.5%。

圖1 鼠脾中Ot特異性片斷擴增產物電泳圖(a-c:野鼠脾PCR產物;d:接種小鼠脾PCR產物;M:1kb marker)Fig.1 The electrophoresis results of PCR products from the spleen of rodents and micea-c:PCR products from the spleen of rodents;d:PCR products from the spleen of inoculated mice;M:1kb marker.

2.4 東方體的分離與鑒定

2.4.1 東方體的分離 用7份鼠臟器標本(黑線姬鼠3份,褐家鼠2份,東方田鼠和鼩鼱各1份)分別接種小鼠,結果僅1份黑線姬鼠臟器接種小鼠出現典型東方體感染癥狀(如聳毛,弓背,厭食,腹部增大),腹壁刮液姬姆薩染色光鏡下見紫紅色東方體顆粒,見圖2。

2.4.2 PCR鑒定 將該小鼠提取臟器DNA做模板,用恙蟲病東方體特異的套式PCR擴增,獲得約200 bp的基因片段。

2.4.3 序列測定 將該基因片段測序(序列已遞交GenBank,列號:JF04210),序列 BLAST顯示該株東方體與臺灣T T0711a株和NT0511b同源性最高為98%。系統發生樹分析也顯示,Sanjie和TT0711a,NT0511b在同一分支,它們又與Kawasaki型共處于同一分支。見表1與圖3。

圖 2 Ot感染小白鼠腹壁刮液 Giemsa涂片Fig.2 Giemsasmearoftheperitonealcellsofot infectious mice

表1 17株恙蟲病東方體sta 56基因的進化距離及其標準差Table 1 Evolutionary distances between 56 kD gene sequences of 17 strains of O.tsutsugamushi

圖3 17株恙蟲病東方體sta 56基因序列構建的系統進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of O.tsutsugamushi strains constructed based on nucleotide sequence of sta 56

3 討 論

近年來,我國恙蟲病病例斷續發生。此與經濟的發展和砍伐森林、興修水利、筑路、旅游等開發自然資源的行為的增多、與自然疫源地的接觸密切,從而導致病例不斷增多。1985年以前我國恙蟲病僅流行在北緯31°以南的廣大地區,1986年后長江以北的山東、江蘇、山西、河北、天津等地相繼發生恙蟲病流行[3-5]。迄今,我國已報導有22個省區均有該病的發生和流行。

恙蟲病在安徽省屬于新發傳染病。歷史上僅休寧1982年報告1例病例[7],接下來25年無病例報告,直到2007年11月,安徽三界地區某部駐軍出現一起恙蟲病暴發流行[2],之后,恙蟲病在安徽省呈高發態勢。2008年阜陽出現恙蟲病暴發流行[8],病例78例,同年,蚌埠也出現數十例恙蟲病病例,2009年,阜陽再次出現恙蟲病暴發疫情,三界地區近幾年也時有散在病例發生。這提示安徽省存在恙蟲病疫源地。安徽省的恙蟲病疫情均發生在10～11月,為秋季型恙蟲病。迄今,長江以北地區所報告病例均屬秋冬型。目前該省恙蟲病疫源地調查工作鮮有報道,病原分離等工作尚屬空白。劉紅等[9]通過對安徽廣德、明光和懷遠3縣農村613份人群血清感染恙蟲病抗體水平的監測發現,3地以明光市恙蟲病血清陽性率最高,達 71.50%;廣德縣較低,為15.50%。家畜血清恙蟲病陽性率也以明光市最高,達80.39%,懷遠縣最低,為2.08%。三界地區位于明光境內,是部隊駐地,當地植被豐富,適合嚙齒動物及螨類孳生,為丘陵平原型疫源地。秋季野外嚙齒動物種類主要是黑線姬鼠、東方田鼠和鼩鼱,農舍室內為褐家鼠,以黑線姬鼠為優勢鼠種,為主要宿主。此次從黑線姬鼠體分離到一株東方體,為安徽省首次報告分離的地方株。在中國,恙蟲病東方體的基因型別主要以Gilliam、Karp和Kawasaki型為主。在長江以南地區主要表現為Gilliam和Karp型[10-11]。長江以北地區分離株主要為Kawasaki和Gilliam型[12-13]。本研究對東方體56 kD序列分析結果顯示,與臺灣TT0711a和NT0511b株同源性最高為98%,進化距離最短為0.066,在進化樹上,它與Kawasaki在同一分支,提示三界地區恙蟲病東方體分離株屬Kawasaki型,這與地理位置較近的江蘇和山東省報道的東方體基因型相似。

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Investigation on rodents infection ofOrientia tsutsugamushiin Sanjie,an area of An Hui province,China

CAO Min,WANG Zhong-can,LU Nian-hong,HUANG Hua-dong,GUO Heng-bin,WANG Chang-jun,ZHANG Xing,TANG Jia-qi
(Centers for Disease Control and Prevention of Nanjing Command,Nanjing,210002China)

The purpose of this study was to investigate the rodents infection ofOrientiatsutsugamushiand determine the genetype of theOtstrain in Sanjie,anhui province.In epidemic season,the rodents were capturied and the mites were collected in the field,then the dominant kind of rodents were determined after classifying and calculating them.The DNA of 40 rodent spleens were detected by PCR;The mice were peritoneal injected by the homogenized spleen of rodents to isolateorientia tsutsugamushiin this region.The partial gene ofOt56 kD outmembrane protein was amplified from the spleen of infectious mice and sequneced.Phylogenetic tree was constructed on the 56 kD gene of 17 strains.The results showed that the captured rodents and the rates of carrying mite were Apodemus agrarius 25,60%(15/25);Rattus norvegicus 11,45.5%(5/11),Microtus fortis 2 and S.inutus Linnaeus with negative carrying mite rate respectively;The DNA of 3 spleen of rodents were positive by PCR usingOtspecific primers.OneOtstrain named Sanjie was isolated from Apodemus agrarius.The gene sequence of Sanjie 56kD protein showed 98%homology with T T0711a and NT0511b strans isolated from Taiwan.Phylogenetic analysis showed that Sanjie was in the same branch with T T0711a and NT0511b,and the three were also in the same branch with kawasaki strain.This study indicated thatOtinfection was presented in rodents from Sanjie and Apodemus agrarius was the main host.The genotype of Sanjie was determined as Kawasaki type.

scrub typhus;rodent;Orientia tsutsugamushi;pathogen isolation;molecular epidemiology

R376

A

1002-2694(2011)08-0721-03

*南京軍區南京軍區重點科研項目(08Z034)和2010年度南京軍區醫學科技創新課題(10MA129)聯合資助

操敏,Email:anniecao2001@yahoo.com

1.南京軍區疾病預防控制中心,南京 210002;

2.解放軍73046部隊衛生隊,三界 239421

2011-04-22;

2011-06-27