亞洲帶絳蟲60S核糖體蛋白L8基因的克隆表達和免疫學分析

王 宇,戴佳琳,黃 江,廖興江

2.貴陽醫學院現代病原生物學實驗室,貴陽 550004;

3.貴陽醫學院多媒體形態學實驗室,貴陽 550004

亞洲帶絳蟲60S核糖體蛋白L8基因的克隆表達和免疫學分析

王 宇1,2,戴佳琳3,黃 江1,廖興江3

目的原核克隆表達亞洲帶絳蟲成蟲60S核糖體蛋白L8基因(TaRPL8),探索其應用前景。方法用RT-PCR方法從亞洲帶絳蟲成蟲cDNA中獲取RPL8基因,克隆到原核表達質粒pET-28a(+)中,在大腸埃希菌BL21/DE3中用IPTG誘導表達,表達產物通過SDS-PAGE進行鑒定,用鎳離子金屬螯合劑親和層析柱進行純化,純化的重組蛋白用蛋白印跡進行免疫學分析。結果PCR、雙酶切及DNA測序結果均表明pET-28a(+)-TaRPL8重組質粒構建成功。SDS-PAGE結果表明目的基因在大腸埃希菌BL21/DE3中獲得高效表達,親和層析獲得了高純度蛋白。重組蛋白可被其免疫的SD大鼠血清識別但不能夠被正常大鼠血清識別,表明其具有免疫原性。結論亞洲帶絳蟲成蟲TaRPL8基因可在大腸埃希菌BL21/DE3中獲得具有免疫原性的表達,為進一步的功能研究奠定了基礎。

亞洲帶絳蟲;60S核糖體蛋白 L8基因;基因克隆;原核表達

2.貴陽醫學院現代病原生物學實驗室,貴陽 550004;

3.貴陽醫學院多媒體形態學實驗室,貴陽 550004

至上世紀70年代以來,在我國臺灣地區、東南亞地區、和我國大陸地區相繼報道了一種帶絳蟲,其成蟲特征幾乎和牛帶絳蟲一致,而囊尾蚴又與豬帶絳蟲極為相似。這種帶絳蟲的中間宿主是豬,人因生食豬肝等內臟而感染。這種帶絳蟲被命名為亞洲帶絳蟲[1-3]。近年來的研究證實在貴州省都勻地區存在亞洲帶絳蟲病的流行。本課題組對該蟲做了一些分子生物學研究,但對核糖體蛋白及其相關基因卻了解甚少。本研究通過構建pET-28a(+)-TaRPL8原核表達載體,并對其原核表達產物進行純化和免疫學初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本來源,質粒,菌株 蟲體標本采自亞洲帶絳蟲流行區貴州省都勻市米秀鄉;原核表達質粒pET-28a(+)和大腸桿菌BL21/DE3由中山大學熱帶病重點實驗室惠贈。

1.1.2 主要試劑和工具酶 Trizol試劑購自美國Invitrogen公司;逆轉錄試劑盒(PrimeScriptTM RT reagent Kit)購自日本TaKaRa公司;T a KaRa Ex Taq 酶、EcoRI、X hoI、DNA 標準(DL15000、DL2000)(大連寶生物工程公司);T4 DNA連接酶、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)(美國 Promega公司);Ni-IDA Agarose(Cat.No.30210)(德國NOVEGN公司);兔抗人IgG試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司);質粒提取試劑盒(廣州東盛科技公司);低分子量蛋白分子量標準為Fermentas公司(立陶宛)產品;DNA凝膠回收試劑盒(廣州鉑爾生物科技公司)。

1.1.3 引物的合成和DNA的測序 基因擴增引物由Introvigen上海生物技術有限公司合成 ,重組質粒DNA的測序由金斯特科技股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 亞洲帶絳蟲成蟲總 RNA的提取及cDNA的合成 取新鮮亞洲帶絳蟲成蟲節片 ,無菌水清洗干凈體表 ,立刻放進DEPC水處理的勻漿器中 ,加入1mLTrizol后勻漿 ,直至樣品全部融化成液體 ,將其移入無菌且 RNase free EP管 ,用力振蕩3min,室溫靜置5min。加入0.2mL氯仿 ,混合后靜置10 min,4℃12 000g離心20 min,小心取上清液到一個新的RNase free EP管中。加入0.5mL異丙醇 ,室溫靜置 10 min,4℃12 000g離心 15 min,棄上清液。沉淀加入 1mL75%乙醇 ,震蕩15s,4℃7 500g離心5min,棄上清液,倒置在超凈臺上10min,加入30μ L純水溶解沉淀 ,所獲得的總RNA保存于 -80℃冰箱中。取適量的RNA樣品合成cDNA[4-6]。反應體系為:模板 2μ L(500ng),5×PrimeScript緩沖液 2μ L,PrimeScript酶混合物0.5μ L,OligodT 和 Random 6 mers引物各0.5μ L,加RNase Free dH2O至總體系為10μ L。反應條件:37℃30min,85℃5 s。-20℃保存備用。

1.2.2 引物的設計合成、基因擴增 根據Gen-Bank上相關60S核糖體蛋白L8基因序列,利用引物設計軟件 Premier 5.0設計引物,上游引物為:5′-CCGGAAT TCAGCGGTGACCGTACAT TCGG-3′;下游引物為:5′-CCGCTCGAGCTACGAACGGACCT TCT TGT-3′。以亞洲帶絳蟲成蟲 cDNA為模板,應用上述設計的特異引物擴增目的基因 ,PCR產物行1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定且回收。

1.2.3 重組原核表達質粒的構建及鑒定 將PCR產物膠回收后和原核表達質粒pET-28a(+)用EcoRI和Xhol進行雙酶切后回收 ,連接、轉化大腸埃希菌BL21/DE3感受態細胞 ,卡拉霉素篩選陽性單克隆 ,提取的重組質粒進行雙酶切、PCR和DNA測序鑒定后進行原核表達[7]。

1.2.4 重組蛋白的誘導表達 挑取含有 pET-28a(+)TaRPL8重組質粒的E.coliBL21/DE3的單菌落接種于含卡那霉素的 LB液體培養基中[空質粒p ET-28a(+)的 BL21/DE3作為陰性對照],放入37°C搖床 ,搖至OD600約為0.6時,取1mL作為誘導前樣品 ,加入IPTG至終濃度為1mmol/L,搖床誘導表達5h后離心收集菌體作為誘導后樣品 ,所有樣品離心后收集菌體離心后取上清行SDS-PAGE電泳分析。

1.2.5 重組蛋白的純化和蛋白質印跡(Western blotting)分析 依據上述誘導表達方法對陽性克隆進行大量的誘導表達 ,離心收集菌體 ,冰上超聲裂解 ,分別取上清和沉淀樣品處理后行SDS-PAGE判斷重組蛋白的可溶性。尿素變性純化重組蛋白,按參考文獻[8]方法進行,用Bradford法測蛋白濃度,并于-80℃保存備用。蛋白質印跡(Western blot)分析。

2 結 果

2.1 RNA提取 對亞洲帶絳蟲成蟲用Invitrogen公司的T rizol試劑提取總RNA,紫外分光光度計測定OD260/280為1.96,見圖1 。

圖1 Total RNA電泳圖Fig.1 Electropherogram of sample total RNA

2.2 原核重組質粒的鑒定、分析 將重組質粒進行PCR和雙酶切鑒定,產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳。結果顯示在250～500bp之間有一清晰的條帶,與目的基因的大小基本相符,證明重組質粒構建成功,見圖2。同時測序結果表明該基因與日本血吸蟲RPL8基因(登錄號為FN330829)的氨基酸序列的同源性達79%,所以命名為亞洲帶絳蟲60S核糖體蛋白L8基因,通過生物信息學分析該基因編碼蛋白的理論分子質量和等電點分別是14123.4Da和8.75。

2.3 蛋白表達純化結果 將構建好的重組質粒轉化到E.coliBL21/DE3中表達,SDS-PAGE電泳分析結果見圖3中第4、5泳道所示,大約在14kDa左右處出現表達條帶,與目的蛋白分子量基本相符。將蛋白進行純化,結果見圖3第7泳道所示,證明目的蛋白純化成功。用Bradford法測該蛋白濃度為0.56mg/mL。

2.4 Western blot鑒定重組蛋白TaRPL8免疫原性 純化得到的重組蛋白TaRPL8行15%SDSPAGE,Western Blot,使用SD大鼠抗重組蛋白TaRPL8的特異抗血清作為一抗,結果顯示特異性抗血清能識別重組蛋白TaRPL8,而正常大鼠血清不能識別,見圖4。

圖2 重組質粒的PCR及雙酶切鑒定M1:DNA標志物2 000;1:從亞洲帶絳蟲cDNA中擴增的 PCR產物;2:重組質粒(pET-28a(+)-Ta RPL8)用 EcoRⅠ和 XhoⅠ酶切;3:重組質粒(pET-28a(+)-Ta RPL8);M2:DNA標志物15 000Fig.2 The identification of the pET-28a(+)Ta RPL8 by PCR amplification and digestion with restriction enzymesM1:DNA Marker DL2 000;1:the PCR product amplified from cDNA of Taenia saginata asiatica;2:the recombinants(pET-28a(+)-Ta RPL8)digested by EcoRⅠand XhoⅠ;3:the recombinants(pET-28a(+)-Ta RPL8);M2:DNA Marker DL15 000

3 討 論

核糖體是生物細胞內的蛋白質合成場所,核糖體蛋白廣泛分布于真核生物的各個組織中,核糖體蛋白除了參與組裝核糖體的大小亞基之外 ,在生物體內還行使其它重要且保守的功能。核糖體蛋白有許多成員 ,有關它們的分類十分清楚 ,但來源不同生物的相應的核糖體蛋白的序列比較保守 ,這為用同源序列來研究系統發育提供了基礎。目前 ,核糖體蛋白序列在分子系統學研究中已有所應用 ,并取得了較好的結果[9]。核糖體蛋白是參與生物系統發育的重要蛋白,在利什曼原蟲疫苗的研究中,已證實具有重要的潛在價值[10]。

圖3 重組質粒的表達及其純化產物的15%SDS-PAGE電泳分析M:蛋白標志物;1:pET-28a(+)質粒未加IPTG誘導;2:pET-28a(+)質粒加IPTG誘導;3:pET-28a(+)-Ta RPL8質粒未加IPTG誘導;4:pET-28a(+)-Ta RPL8質粒加IPTG誘導;5:pET-28a(+)-Ta RPL8質粒加IPTG誘導后上清;6:pET-28a(+)-Ta RPL8質粒加IPTG誘導后沉淀;7:pET-28a(+)-Ta RPL8質粒加IPTG誘導后沉淀純化產物Fig.3 15%SDS-PAGE analysis of the prokaryotic expression product and purified productM:Protein marker;1:pET-28a(+)trantformants without IPTG induction;2:pET-28a(+)trantformants with IPTG induction;3:pET-28a(+)-Ta RPL8 trantformants without IPTG induction;4:pET-28a(+)-Ta RPL8 trantformants with IPTG induction;5:insoluble protein of pET-28a(+)-Ta RPL8 trantformants;6:sediments of lysate pET-28a(+)-Ta RPL8with IPTG induction;7:purification of insoluble protein of pET-28a(+)-Ta RPL8 trantformants

圖4 重組Ta RPL8蛋白的免疫原性M.蛋白標志物;1:重組蛋白免疫SD大鼠后血清;2:健康大鼠血清Fig.4 Immunogenicity of recombinated Ta RPL8M:protein marker;1:recombinanted pET-28a(+)-Ta RPL8 reacted with serum form immunized SD rat;2:crude antigens reacted with serum from normal rat

本實驗成功從亞洲帶絳蟲成蟲cDNA中獲得60S核糖體蛋白RPL8基因并構建了pET-28a(+)-TaRPL8重組質粒,測序后序列經 NCBI網站Blastx在線分析 ,該基因序列編碼的氨基酸序列與GenBank中日本血吸蟲 RPL8基因(登錄號為FN330829)的氨基酸序列的同源性可達到79%,并具有完整的RPL8保守功能域 ,該序列含有完整的開放閱讀框 ,是一個全長cDNA序列。預測其編碼的蛋白相對分子量理論值是14 123.4Da,理論等電點8.75,蛋白的理化性質較穩定。Western Blotting結果表明純化蛋白能被重組蛋白免疫的SD大鼠血清識別而不能夠被正常SD大鼠血清識別 ,說明重組蛋白具有免疫原性。同時亞洲帶絳蟲成蟲60S核糖體蛋白RPL8的獲得是對絳蟲核糖體蛋白研究的重要補充,為今后更多核糖體蛋白序列的獲得及相關功能研究提供了參考。

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Cloning and prokaryotic expression of 60S ribosomal protein L8 gene ofTaenia saginata asiaticaand analysis on immunogenicity of the recombinant protein

WANG Yu,DAI Jia-lin,HUANG Jiang,LIAO Xing-jiang
(Department of Parasitology,Guiyang Medical College,Guiyang550004,China)

To clone and express the novelgene named 60S ribosomal protein L8 gene ofTaenia saginata asiatica(TaRPL8)in order to analyze the immunogenicity of the recombinant protein.The full-length cDNA of RPL8 gene was cloned fromTaenia saginata asiaticausing RT-PCR;and cloned into the prokaryotic expression vector pET-28a(+)and then expressed inE.col iBL21 with IPTG induction.The recombinant protein was detectedby SDS-PAGE and purified by Ni-IDA affinity chromatography.And its immunogenicity was analyzed by Western Blotting.PCR,double enzyme digestion and DNA sequencing confirmed that the recombinant expression plasmid was successfully constructed.The expression products were obtained and purified by Ni-IDA affinity chromatography.Western blot analysis ofT.a.RPL8 recombinant protein testified that it could be recognized by immunized SD rat serum but couldn't be recognized by normal SD rat,which indicated its immunogenicity.It＇s suggested that a novel gene coding RPL8 ofTaenia saginata asiaticawas cloned,expressed,purifiedand identified successfully.The purified protein ofTaRPL8 coule be of importance for further research on the biological function of the gene.

Taenia saginata asiatica;60S ribosomal protein L8 gene;molecular cloning;prokaryotic expression

R383

A

1002-2694(2011)08-0731-03

*國家自然科學基金資助項目(No.30760227)和貴州省科技攻關項目[黔科合NY字(2008)3060]聯合資助

黃江,Email:mmm_hj@gmc.edu.cn

1.貴陽醫學院寄生蟲學教研室,貴陽 550004;

2010-11-01;

2010-01-14