補腎活血合劑對糖尿病性陽痿大鼠陰莖平滑肌組織作用機理的實驗研究*

張國豪，方再軍，張國治

(1．中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院，北京 100053;2．貴州茅臺酒廠職工醫(yī)院，貴州 仁懷 564501;3．仁懷市人民醫(yī)院，貴州 仁懷 564500)

補腎活血合劑對糖尿病性陽痿大鼠陰莖平滑肌組織作用機理的實驗研究*

張國豪1，方再軍2，張國治3

(1．中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院，北京 100053;2．貴州茅臺酒廠職工醫(yī)院，貴州 仁懷 564501;3．仁懷市人民醫(yī)院，貴州 仁懷 564500)

目的:觀察補腎活血合劑對糖尿病(DM)性陽痿(ED)大鼠陰莖半滑肌組織的作用機理。方法:將實驗小鼠用2%鏈脲佐菌素液按60mg/kg，腹腔注射建立糖尿病模型，然后在每只糖尿病模型大鼠頸項處注射阿樸嗎啡80ug/kg，錄像記錄陰莖勃起次數(shù)。篩選DM性ED模型，將DM性ED模型隨機分為正常組、模型組、中藥高、低劑量組、達美康組、達美康 +安雄組。除正常組外，其余各組連續(xù)給藥l2周，然后處死測定陰莖海綿體膠原纖維，血竇結(jié)構(gòu)，平滑肌組織病理改變。結(jié)果:補腎活血活劑對膠原纖維，血竇結(jié)構(gòu)，平滑肌有改變。結(jié)論:補腎活血合劑對糖尿病陽痿大鼠陰莖平滑肌有明顯效果。

補腎活血合劑;糖尿病;陽痿;陰莖海綿體平滑肌

陰莖勃起功能障礙為糖尿病常見的慢性并發(fā)癥，其發(fā)病機理醫(yī)學界分別從血管、神經(jīng)、內(nèi)分泌，約物及心理因素等方面進行了探討，但發(fā)病機理仍不很清楚。本文通過建立DM性 ED大鼠模型，主要從DM性ED大鼠陰莖平滑肌功能作用機理方面，通過免疫組化實驗研究探討中藥對糖尿病性陽痿的防治機理，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 藥品 補腎活血合劑(山淫羊藿、葛根、川芎等組成，生藥2g/ml，由四川省人民醫(yī)院制劑室制備;達美康，法國施維雅藥廠、天津華津制藥廠合作(80mg/片);安雄，南京歐加農(nóng)制藥有限公司(40mg/粒)。

1．1．2 動物 健康 SD雄性大鼠 l20只，體重250g～300g，由成都中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。

1．1．3 儀器 日立全自動生化分析儀(型號7170-A)，Y-計數(shù)儀(型號 FJ200δ P，西安二六二廠)，O1ymPus光學顯微鏡(日本)，MIAS-2000型圖形圖像分析系統(tǒng)，四川大學圖形圖像研究所提供。

1．2 方法

1．2．1 動物造模及分組 造模方法:禁食8h后，新鮮配制2%鏈脲佐菌素液按60mg/kg，對110只大鼠分別左下腹腔內(nèi)注射，5d后取血(取血前禁飼8h)，分離血清送成都中醫(yī)藥大學附院檢驗科檢測血糖，選取血糖值在 11．1mmol/L～22．2mmol/L的大鼠進入試驗。

陰莖勃起試驗 仿照文獻［1］造模方法。將大鼠放觀察箱適應(yīng)環(huán)境10 min，然后在每只大鼠頸項處注射阿樸嗎啡80ug/kg，AP0溶解于0．5mg/kg生理鹽水中，調(diào)整體積為5ml/kg。每只大鼠觀察30 min，錄像記錄陰莖勃起情況及勃起次數(shù)。陰莖頭充血及末端陰莖體出現(xiàn)為陰莖勃起1次，然后篩選ED病例作為DM性ED動物模型。SD大鼠110只共造成DM模型 98只，98只中有 ED者61只，DM并ED62%，隨機分成5組:正常組:10只;模型組:12只;中藥高劑量組(相當于成人劑量 10倍 5．4g/kg):12只;中藥低劑量組(相當于成人劑量5倍2．7g/kg):12只;達美康組(相當于成人劑量10倍22．86mg/kg):12只;達美康+安雄組(相當于成人劑量10倍22．86mg/kg+11．84mg/kg):12只。以上各組均自由飲水，除正常組10只外，各組動物均為12只，以上各治療組連續(xù)給藥12周后，經(jīng)股動脈放血處死，摘除陰莖并測定陰莖體積及做相關(guān)免疫組化測定。

1．3 觀測指標與測定方法

1．3．1 陰莖體積 用水取代法測量陰莖體積(單位 ml)。

1．3．2 血糖 用酶法檢測。

1．3．3 染色方法 陰莖海綿體膠原纖維、血竇結(jié)構(gòu)、平滑肌組織，用Masson三色染色法。

1．3．4 病理學檢測方法 (1)陰莖海綿體組織結(jié)構(gòu)的觀察:取相同部位陰莖海綿體組織(陰莖中后段)，10%中性甲醛液固定48h，逐級酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋，連續(xù)切片8張，切片厚度4μm，其中第1張切片做Masson染色，第2～8張切片做免疫組化染色，操作步驟根據(jù)文獻［2］操作。在200×鏡下觀察Masson染色片陰莖海綿體組織結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果膠原纖維呈綠色，肌纖維呈紅色，紅細胞呈橘紅色;(2)Masson染色分析:每張切片隨機取5個視野(200×)，定量測染色為紅色平滑肌，綠色膠原纖維和血竇的面積等二維參數(shù)。膠原表示，陰莖海綿體中膠原成分的變化，平滑肌表示陰莖海綿體組織中平滑肌成分的變化，血竇表示陰莖海綿體血管系統(tǒng)變化，以上變化反映對陰莖舒張的影響。

1．4 檢測指標的意義

1．4．1 面積 截面的面積是形態(tài)定量分析中常用的參數(shù)。截面的面積等于落在截面內(nèi)的像素點計數(shù)乘以每個測試像素點所代表的測試面積(a=d2k2Pc)，單位 um2。

1．4．2 積分光密度(IOD) 表述被測個體截面積內(nèi)光密度的積分值，亦即是吸光物質(zhì)的總含量，IOD越大，說明測定物質(zhì)的量或染色反應(yīng)后顏色越深，故量越多。

1．4．3 平均光密度 表述被測個體截面或投影輪廓單位面積內(nèi)吸光物質(zhì)各像素光密度的平均值，由積分光密度除以測試框內(nèi)像素數(shù)目獲得。

1．4．4 平均黑度 即平均灰度，指被分析的圖像各部分染色顏色的平均深淺度，平均黑度越大，即染色越深，被染物質(zhì)的量越多。

2 統(tǒng)計學處理

3 結(jié)果

3．1陰莖體積

表1顯示，各組實驗大鼠陰莖體積比較無多大變化，比較無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

表1 各組大鼠陰莖體積比較(±s)

表1 各組大鼠陰莖體積比較(±s)

組別 例數(shù)(只) 體積(單位ml3)正常組中低組模型組達美康組中高組達 +安 組10 99999 0．45 ±0．15 0．40 ±0．11 0．38 ±0．16 0．40 ±0．17 0．41 ±0．20 0．39 ±0．18

3．2 陰莖膠原纖維、血竇和平滑肌

表2～4圖1～4顯示，模型組與正常組比較，膠原纖維含量增多;血竇的周長和面積變小，竇腔變窄;平滑肌面積、平均黑度、平均光密度和積分光密度比正常組少。經(jīng)用中藥制劑治療后，陰莖膠原纖維含量減少，竇腔擴張;平滑肌面積、平均光密度、積分光密度和平均黑度增多，與模型組比較有顯著性差異(P ＜0．01)。

表2 各組大鼠陰莖海綿體膠原纖維含量比較(±s)

表2 各組大鼠陰莖海綿體膠原纖維含量比較(±s)

注:與正常組比較:*P ＜0.05，＊＊P ＜0．01;與模型組比較:#P ＜0．05，##P ＜0．01(下同)

組 別 例數(shù)(只) 面積(μm2)平均光密度 積分光密度 平均黑度正 常 組 10 1579．08 ±1197．04 156．97 ± 7．40 305935．06 ± 207957．92 65．11 ± 8．34中 低 組 9 3064．39 ±1258．43## 166．95 ±36．57## 496624．26 ± 250012．74## 71．38 ± 9．80##模 型 組 9 8878．89 ±4366．14＊＊ 192．47 ±11．34＊＊ 1486841．71 ± 703910．69＊＊ 98．03 ± 7．40＊＊達 美 康 組 9 3970．95 ±1188．60## 185．30 ± 6．35## 564935．47 ± 331737．92## 74．05 ±17．51##中 高 組 9 2549．48 ±1604．48## 159．89 ± 8．34## 424421．62 ±4610420．26## 69．69 ± 6．35##達 + 安 組 9 4537．86 ±3227．88## 190．95 ±17．51## 784929．65 ± 234494．98## 95．84 ±37．28##

3．3 血糖

表5顯示，從各組實驗大鼠比較可知，經(jīng)治療后各組與模型組比較血糖值下降有顯著性差異(P＜0．01)。

表6顯示，模型組同治療各組治療前后空腹血糖值無顯著性差異，與正常組比較有顯著性差異綿體平滑肌纖維受損、細胞數(shù)目減少、結(jié)締組織增多、血管粥樣硬化，血管障礙等有關(guān)［3、4］。

表3 各組大鼠陰莖海綿體血竇結(jié)構(gòu)的比較(±s)

表3 各組大鼠陰莖海綿體血竇結(jié)構(gòu)的比較(±s)

組 別 例數(shù)(只) 面積(μm2) 周長(um) 最大直徑(um)正 常 組 10 9523．16±4137．98 493．87±122．22 150．07±16．73中 低 組 9 8505．49 ±4571．58 435．22 ±137．77 135．78 ±15．68模 型 組 9 4800．48 ±2306．33＊＊ 347．47 ±94．33 96．74 ±23．17＊＊達 美 康 組 9 5718．13 ±2038．76 398．91 ±150．53 118．86 ±38．07中 高 組 9 9254．00 ±1106．72## 493．22 ±127．49## 142．28 ±24．76##達 + 安 組 9 5447．37 ±2464．91 352．49 ±184．33 105．43 ±35．19

表4 各組大鼠陰莖海綿體平滑肌組織比較(±s)

表4 各組大鼠陰莖海綿體平滑肌組織比較(±s)

組別 例數(shù)(只) 面積(μm2)平均光密度 積分光密度 平均黑度正 常 組 10 522．02 ±225．04 195．62 ±10．94 1955612．49 ±3950075．09 89．38 ± 10．94中 低 組 9 387．49 ±132．47## 185．08 ±12．78## 85671．76 ± 33466．75## 76．12 ± 8．25##模 型 組 9 288．24 ±117．41＊＊ 152．69 ±11．48＊＊ 43400．86 ± 26303．79＊＊ 61．65 ±12．12＊＊達 美 康 組 9 362．58 ±315．54## 178．88 ± 8．25## 74152．93 ± 58791．84## 69．70 ± 7．36##中 高 組 9 495．74 ±182．78## 185．88 ±16．72## 97742．03 ± 30661．30## 79．92 ±12．78##達 + 安 組 9 346．21 ±144．64## 175．29 ± 7．36## 49484．59 ± 49290．93## 69．13 ±16．72##

表5 各組大鼠治療后空腹血糖(FBG)比較(±s)

表5 各組大鼠治療后空腹血糖(FBG)比較(±s)

注:與正常組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0．01;與模型組比較:#P＜0.05，##P ＜0．01，治療前后比較:△P ＜0.05，△△P ＜0．01

組別 例數(shù)(只) 治療前mmol/L 治療后mmol/L正 常 組10 6．25 ± 1．03 7．01 ± 1．12中 低 組 9 13．98 ±2．07△△ 10．45 ±1．21*##模 型 組 9 14．19 ±2．27△△ 31．88 ±4．59達 美 康 組 9 14．09 ±2．25△△ 8．96 ±2．42＊＊##中 高 組 9 14．01 ±3．15△△ 8．56 ±3．05＊＊##達 + 安 組 9 3．88 ±2．14△△ 8．87 ±3．17＊＊##

在正常情況下，陰莖海綿體平滑肌松弛，動脈血管擴張，血流加快，陰莖脹大，陰莖海綿體壓力增強，靜脈閉阻，使達到能性交的勃起狀態(tài)，陰莖海綿體平滑肌細胞在勃起過程中具有關(guān)鍵作用。

組織學研究顯示，陰莖動脈供血不足，海綿體內(nèi)膠原聚集導致勃起功能障礙，超微結(jié)構(gòu)的特征性改變使血管性勃起功能障礙的患者平滑肌細胞再生不良和萎縮及細胞外基質(zhì)(主要是膠原纖維)聚結(jié)。海綿體內(nèi)膠原成分的增加和海綿體血竇內(nèi)平滑肌細胞數(shù)的下降與勃起功能障礙有關(guān)。

勃起功能障礙病理在于海綿體平滑肌的改變，糖尿病并勃起功能障礙的病理表現(xiàn)在:平滑肌纖維數(shù)量減少，神經(jīng)組織受體減少或缺乏。特別是細胞內(nèi)收縮和舒張的基本結(jié)構(gòu)成分肌原纖維有明顯損害、早衰，膠原纖維增生，海綿體纖維化，從而使平滑肌收縮和舒張功能受到嚴重損害。在血管方面，陰莖小動脈內(nèi)膜增厚，內(nèi)皮下層水腫，中膜肌層的肌纖維分離、纖維增生和鈣化，嚴重者則管腔狹窄。

本實驗采用免疫組織和Masson染色(顯示平滑肌細胞膠原組織和血竇)對陰莖海綿體染色結(jié)果進行測量，顯示海綿體平滑肌、膠原纖維及血竇之間的關(guān)系。結(jié)果表明，中藥制劑治療后陰莖膠源纖維含量減少，竇腔擴張，平滑肌面積，平均光密度、積分光密度和平均黑度增多，說明中藥制劑具有改善陰莖膠原纖維、血竇和平滑機作用。

中醫(yī)學理論認為，陽痿與消渴病病機演化密切(P＜0．01)，經(jīng)治療后，治療各組與模型組比較血糖值下降(P ＜0．01)。

4 討論

陽痿即勃起功能障礙，其病理改變?yōu)槠交p少，膠原纖維發(fā)生增生，常表現(xiàn)為陰莖海綿體纖維化［3］。陽痿是糖尿病常見并發(fā)癥，主要是與糖尿病變引起外周血管疾病，特別是血管內(nèi)皮細胞凋亡、海相關(guān)。消渴病病理本質(zhì)是陰虛燥熱，陰損及陽，轉(zhuǎn)化為氣陰兩虛，陰陽俱損，腎陽不振，溫煦失職，則前陰不能振奮而勃起，無論是氣陰兩虛，陰陽俱損，命門火衰，都容易造成瘀血內(nèi)阻，消渴并發(fā)陽痿，在瘀血的病機上都與腎密切相關(guān)，治療上補腎活血，溫陽振痿。補腎活血合劑淫羊藿、川芎、葛根等組成，該方具有溫腎壯陽，活血化瘀，降糖起痿功效。藥理研究表明，淫羊藿具有提高性機能，增加附性器官重量，提高血漿睪酮含量［5］，葛根、川芎活血化瘀，能使微循環(huán)血流加速，增大管徑，抑制血小板聚結(jié)，葛根素能降低血糖，因此該處方組成約物具有改善糖、脂代謝［6～9］，改善血液循環(huán)，提高機體免疫功能及抗衰老、提高性功能。抗自由基損傷，抑制脂質(zhì)過氧化和改善血管活性調(diào)節(jié)平滑肌舒張作用。通過以上綜合作用，保護陰莖海綿體平滑肌，抑制海綿體平滑肌及血竇，膠原纖維的病理改變。

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Experimental study on effect of Bushen Huoxue Heji on the tissue of corpus cavernosum smooth muscle in diabetic impotence rats

ZHANG Guo-hao，F(xiàn)ANG Zai-jun，ZHANG Guo-zhi
(1．Guang anmen Hospital of China Academy of Chinese Medical Science，Beijing100053，China;2．Hospital of Mao-Tai Chiew Factory in Guizhou Province，Renhuai，Guizhou564501，China;3．People’s Hospital of Renhuai，Renhuai，Guizhou564501，China)

Objective:Observing the effects of the reinforcing kidney and activating blood recipe affecting the tissue of corpus cavernosum smooth muscle of DMED-rats．Methods:An animal model of diabetes was induced by a single intravenous dose of streptozotocin(STZ，60mg/kg body weight)in Wistar rats．Recording the numbers of penile erection of eath rat by camera after subcutaneous inject of apomorphine(80μg/kg)．Screening the modle of STZ-rats with erectile dysfunction and grouping into 6 groups:control group，modle group，Chinese Medicine group，low-dosage group，Diamicron group，Diamicron combined Testosterone Undecanoate group，After administrating 12 weeks，observed the change of collagenous fiber of The penis sponge body，Blood sinus structure and the Organization pathological changes of Smooth muscle tissue Organization pathological changes．Results:the reinforcing kidney and activating blood recipe can improve the value of collagenous fiber of corpora cavernosa penis，Blood sinus structure and the Organization pathological changes of Smooth muscle tissue Organization．Conclusion:the reinforcing kidney and activating blood recipe has significant profective effect of the tissue of corpus cavernosum smooth muscle of DMED-rats．

reinforcing kidney and activating blood recipe;diabetes mellitus;erectile dysfunction;The penis sponge body smooth muscle

R285．5

B

1006-3250(2011)12-1338-03

貴州省中醫(yī)藥管理局重點項目(黔中發(fā)2005-30)

2011-02-26

張國豪(1968-)，男，貴州茅臺人，副主任醫(yī)師，碩士研究生導師，博士后，從事中西醫(yī)結(jié)合防治內(nèi)分泌系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)疾病的臨床、科研與教學，Tel:13158126293，E-mail:mt zhang guo hao 163．com。