血府逐瘀湯誘導內皮細胞遷*移中Ⅳ型膠原酶的作用研究

高 冬，陳文元，鄭良樸，林 薇，吳立婭，宋 軍，陳可冀

(1．福建中醫藥大學中西醫結合學院，福州 350108);2．福建中醫藥大學中西醫結合研究院，福州 350108;3．中國中醫科學院醫學實驗中心，北京 100700;4．中國中醫科學院西苑醫院，北京 100091)

血府逐瘀湯誘導內皮細胞遷*移中Ⅳ型膠原酶的作用研究

高 冬1，陳文元1，鄭良樸2，林 薇2，吳立婭1，宋 軍3△，陳可冀4

(1．福建中醫藥大學中西醫結合學院，福州 350108);2．福建中醫藥大學中西醫結合研究院，福州 350108;3．中國中醫科學院醫學實驗中心，北京 100700;4．中國中醫科學院西苑醫院，北京 100091)

目的:探討血府逐瘀湯影響Ⅳ型膠原酶誘導內皮細胞遷移的作用。方法:運用血清藥理學方法，以1．25%、2．5%和5%濃度的血府逐瘀湯含藥血清和空白血清培養人臍靜脈內皮細胞ECV304，采用Boyden小室遷移法檢測藥物對內皮細胞遷移的影響，并通過酶聯免疫法和RT-PCR檢測明膠酶A(MMP-2)和明膠酶B(MMP-9)分泌和表達的情況。結果:1．25%濃度含藥血清對上述指標無影響，2．5%和5%濃度含藥血清可顯著提高內皮細胞遷移、MMP-2和MMP-9轉錄及細胞培養上清液中MMP-2和MMP-9水平。結論:血府逐瘀湯通過提高Ⅳ型膠原酶的表達進而誘導內皮細胞遷移，提示藥物促血管新生功能可能與該作用相關。

血府逐瘀湯;細胞遷移;MMP-2;MMP-29

血府逐瘀湯是臨床常用的活血化瘀經典方，本項目組前期體內、體外實驗，從內皮祖細胞和內皮細胞等不同角度、不同層面的系列工作均表明該方劑具有顯著的促血管新生作用，為該方劑治療缺血性疾病臨床療效提供了部分實驗依據［1-6］，但藥物促血管新生多途徑、多靶點的復雜機制尚未闡明清晰。血管新生是在原有管腔基礎上，由內皮細胞以出芽的方式擴增、遷移并相互聯結形成血管內膜腔，進而成為新血管的過程。內皮細胞的遷移是血管新生的關鍵步驟［7］，而Ⅳ型膠原酶在細胞遷移中發揮重要作用，故本研究以內皮細胞ECV304為實驗模型，探討Ⅳ型膠原酶在血府逐瘀湯誘導內皮細胞遷移中的作用，為該方劑促血管新生的藥效機制研究提供進一步的支撐材料。

1 材料與方法

1．1 藥物制備

血府逐瘀湯中各藥量分別為當歸9g，生地9g，桃仁 12g，紅花 9g，枳殼 6g，赤芍 6g，柴胡 3g，甘草6g，桔梗 4．5g，川芎 4．5g，牛膝 9g，購自福建中醫藥大學中醫藥研究院。該方水煎2次煎液過濾，混合后加熱濃縮至含生藥量1．3g/ml、4℃保存備用。

1．2 含藥血清制備

6周齡 SD大鼠，體重150g±20g，雌雄各半，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供(動物批號NO．0037614)，在福建中醫藥大學實驗動物中心普通飼料喂養，自由飲水，隨機分為藥物組和空白對照組，每組6只。藥物組以13g/kg劑量灌胃給予血府逐瘀湯，空白對照組采用等量生理鹽水灌胃，2次/d，連續7d，于第8天給藥2h后3%戊巴比妥鈉麻醉、腹主動脈取血，靜置1h后，4000rpm離心30min分離血清，經 56℃ 滅活 30 min，0．22μm 過濾除菌后，置－20℃保存。

1．3 試劑及設備

明膠，戊巴比妥鈉(美國，SIGMA公司)，GIBCOTMM199培養基干粉，Trizol，引物(美國，Invitrogen公司)，南美胎牛血清(Fetal Bovine Serum，FBS)、胰蛋白酶-EDTA(Trypsin-EDTA)、

1．4 HUVECs培養及含藥血清處理

HUVECs購于武漢大學中國典型培養物保藏中心，采用含5%FBS的M199培養液，于37℃ 5%CO2中培養至匯合后同步化處理，以2．5×105個/ml密度接種，培養4h待細胞貼壁后棄去培養液，細胞隨機分成藥物組和空白組，分別更換1.25%、2．5%和5%血府逐瘀湯含藥血清和空白對照血清，繼續培養48h開展各項實驗。

1．5 遷移實驗

收集各組細胞培養上清液將其置于boyden小室的下室，中間置以0．5%明膠預包被的孔徑8μm的聚碳酸酯膜，上加入對應組別的HUVECs2×104個，于37℃ 5%CO2培養箱中培養16h。聚碳酸酯膜上室面的 HUVECs以棉簽輕輕刮去，下室面的HUVECs以中性甲醛固定，蘇木素常規染色，400×視野下隨機計數6個視野細胞數。

1．6 MMP-2和 MMP-9表達檢測

采用RT-PCR法，Trizol提取細胞內總 RNA，取總RNA 1μg進行逆轉錄反應，操作按 RevertAid?First Strand cDNA Synthesis Kit說明書進行。引物序列見表1。

1．7 上清液MMP-2和MMP-9含量檢測

取各組細胞培養上清液采用酶聯免疫法檢測，具體步驟按試劑盒說明書進行。

2 結果

2．1 血府逐瘀湯對細胞遷移能力的影響

遷移實驗的檢測結果(圖1、表1)顯示，3個不同血清濃度的空白對照組之間沒有顯著差異，與空延伸 45s，經35個循環，72℃補齊10 min后電泳檢測 白對照組相比，2．5% 和5．0%的含藥血清可提高細胞的遷移能力，使得遷移到下室面的細胞數量明顯升高(P＜0．01)。

表1 EUSA檢測結果

圖1 血府逐瘀湯影響內皮細胞遷移的實驗結果(×200)

表2 血府逐瘀湯對內皮細胞遷移及Ⅳ型膠原酶的影響結果(±s，n=6)

表2 血府逐瘀湯對內皮細胞遷移及Ⅳ型膠原酶的影響結果(±s，n=6)

注:與相同血清含量的空白組比較:*P ＜0．05，#P ＜0．01

檢 測 項 目 含藥血清量(%)空白血清量(%)1．25 2．5 5 1．25 2．5 5遷移數量(個) 47．50 ± 4．85 59．17 ± 7．03# 62．00 ± 6．36#38．00 ± 6．13 42．67 ± 6．06 43．17 ± 5．12 MMP-2 含量(ng/ml) 208．00 ±18．56 258．33 ±14．99# 289．50 ±10．01# 200．00 ±17．41 200．00 ±17．41 225．67 ±23．45 MMP-9 含量(pg/ml) 342．50 ±17．67 519．67 ±25．56* 608．83 ±33．18# 357．00 ±28．31 458．33 ±35．99 533．50 ±21．33 MMP-2 表達灰度值 0．18 ± 0．01 0．22 ± 0．01# 0．22 ± 0．01# 0．16 ± 0．01 0．18 ± 0．01 0．17 ± 0．01 MMP-9 表達灰度值 0．54 ± 0．01 0．67 ± 0．02# 0．71 ± 0．02#0．55 ± 0．01 0．56 ± 0．02 0．56 ± 0．02

圖2 血府逐瘀湯影響Ⅳ型膠原酶表達的RT-PCR實驗結果

2．2 血府逐瘀湯對MMP-2和MMP-9表達的影響

RT-PCR的檢測結果(圖2、表1)表明，與相同血清濃度的空白對照組相比，2．5% 和5．0%含藥血清可顯著提高MMP-2和MMP-9的轉錄水平(P＜0.01)。

2．3 血府逐瘀湯對 MMP-2和 MMP-9含量的影響

ELISA檢測結果(表1)顯示，從3個不同血清含量的空白組來看，細胞培養上清液中MMP-2含量與血清濃度無關，而MMP-9水平隨著血清含量的升高呈上升趨勢，以5%空白血清組的含量最高，說明培養體系中的血清含量僅影響MMP-9的分泌。為了撇清血清的影響因素，采用藥物組與同等血清含量的空白組相比，其中2．5% 和5．0%含藥血清均可顯著提高上清液中MMP-2和MMP-9的水平，較低濃度的藥物無顯著影響，提示藥物具有提高MMP-2和MMP-9含量的作用。

3 討論

基質金屬蛋白酶 (matrix metalloproteinases，MMPs)因其活性需要 Ca2+、Zn2+等金屬離子作為輔助因子而得名，MMPs幾乎能降解細胞基質中的各種蛋白成分，在腫瘤侵襲、細胞遷移中發揮關鍵性作用進并日益受到重視。目前MMPs家族已分離鑒別出26個成員，根據作用底物以及片斷同源性，將MMPs分為4類，而對Ⅳ型膠原酶的研究較深入。Ⅳ型膠原酶包括非糖化明膠酶A(MMP-2)和糖化明膠酶B(MMP-9)，兩者在結構上除含有該家族所共有的氨基末端和鋅離子結合區域外，還在催化部位含有區別于其他家族成員的類似Ⅱ型類纖黏連蛋白的明膠結合部位，最大的結構差異在于MMP-9多了一段長度為54個氨基酸殘基的富含脯氨酸序列。它們都以酶原的形式分泌，被激活后形成Ⅳ型膠原酶，通過降解、破壞靠近細胞外基質中的各類膠原和明膠等蛋白，使細胞沿著缺失的基質膜向周圍組織遷移。

細胞基質的水解和重建是血管新生所有步驟中最為重要的、影響到內皮細胞遷移和管腔的形成［8］，MMP-2和 MMP-9蛋白抑制劑能極大減弱內皮細胞的遷移［9］，MMP-2和 MMP-9缺失小鼠血管新生減弱［10-12］，而其抑制劑具有抑制血管新生的作用［13、14］，且內皮細胞分泌的 MMP-2 無論對生理或病理性血管新生的具體步驟，包括內皮細胞增殖、分化和遷移等都是必不可少的［15、16］。本實驗結果說明，血府逐瘀湯可通過升高MMP-2和MMP-9的表達水平，提高內皮細胞的遷移能力，進而發揮促血管新生作用。

MMPs的活性受到基因表達、酶原激活以及特異性抑制因子3個水平的調節。本實驗針對藥物影響Ⅳ型膠原酶基因表達這個環節展開探討，要全面明確Ⅳ型膠原酶在血府逐瘀湯促內皮細胞遷移中的作用機制，還需要從另外兩方面進一步深入研究。此外，聯系本項目組以往的研究工作我們發現，血府逐瘀湯促內皮細胞的遷移作用不僅與本研究的MMPs相關，還與VEGF、bFGF和 NO等血管新生調控因素關系密切［6］，這個現象不僅驗證了藥物促血管新生的作用機制呈多途徑、多靶點的結論，而且為今后的探索拓展了新思路。

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The effect of type IV collagenase on endothelial cell migration induced by Xuefu Zhuyu Decoction

GAO Dong1，CHEN Wen-yuan1，ZHENG Liang-pu2，LIN Wei2，WU Li-ya1，SONG Jun3△，CHEN Kei-ji4
(1．College of Integrative Medicine，Fujian University of Tradition Chinese Medicine，Fuzhou350108，China;2．Fujian Academy of Integrative Medicine Fuzhou350108，China;3．The Experimental Research Center China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing100700，China;4．Xiyuan Hospital，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing100091，China)

Objective:To investigate the effect of type IV collagenase on endothelial cell migration induced by Xuefu Zhuyu Decoction(XFZYD)．Methods:Serum pharmacology technique was adopted．Endothelial cells ECV304 were treated with blank serum or XFZYD containing serum(XFZYD-CS)at final concentrations of 1．25% ，2．5%and 5% ．Boyden chamber assay was performed to test cell migration function．ELISA and RT-PCR was used to estimate MMP-2 and MMP-9 level in cell supernatant and their transcription．Results:Final concentration of 2．5%and 5%XFZYD-CS promoted cell migration as well as MMP-2 and MMP-9 level and their transcription remarkably．Conclusion:XFZYD could induce ECV304 migration through high expression of MMP-2 and MMP-9．This might account for partial mechanism of angiogenesis effect induced by XFZYD．

Xuefu Zhuyu Decoction;cell migration;MMP-2;MMP-9

R285．5

B

1006-3250(2012)01-1341-02

國家自然科學基金項目(81072933);福建省自然科學基金項目(2007J0101);福建省“中西醫結合基礎與臨床”創新團隊項目(CKJ2008001)

2011-07-11

高 冬(1967-)，女，教授，醫學碩士，從事血管新生研究，Tel:0591-22861151，E-mail:gd1026@yahoo．com．cn。

△通訊作者:宋 軍，Tel:010-64014411-3325，E-mail:junsong86@sohu．com。