兒童肺炎鏈球菌血清型分布及其對抗菌藥物的耐藥性

張 泓， 李萬華，孔 菁， 王 春，陸 敏，陸 權

肺炎鏈球菌(S.pneumoniae)是兒童社區獲得性感染的主要病原菌，可引起肺炎、腦膜炎、菌血癥、中耳炎、鼻竇炎等疾病，發病率和病死率高。20余年來，青霉素耐藥肺炎鏈球菌(PRSP)感染，給治療帶來困難，已成為全球關注的嚴重問題。肺炎鏈球菌疫苗是預防兒童呼吸道感染的重要手段，也是預防耐藥菌擴散的措施之一。本研究檢測2007年10月—2008年5月我院呼吸科患兒鼻咽分泌物分離肺炎鏈球菌的血清型分布及不同血清型菌株對抗菌藥物的耐藥狀況，為控制耐藥傳播和疫苗免疫預防的可行性提供理論依據。

材料與方法

一、材料

(一)菌株來源 菌株分離自2007年10月—2008年5月我院呼吸科患兒鼻咽分泌物分離的肺炎鏈球菌338株，其中分離自2歲以下嬰幼兒192株，分離自2～5歲兒童146株。

(二)多價血清和培養基 多價血清為丹麥血清研究所(Statens Serum Institut，Denmark)商品。藥敏試驗用MH培養基為英國OXOID公司商品。

(三)抗菌藥物 抗菌藥物E試驗紙片為法國生物梅里埃公司商品。抗菌藥物品種見結果部分。

二、方法

(一)血清分型 采用莢膜腫脹試驗進行血清分型。操作步驟按照文獻［1］進行。購買的血清能明確判定 23 價多糖疫苗覆蓋的血清型(1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、l8C、19A、19F、20、22F、23F 和 33F)和 6A，此外的血清型在本研究中不能分型。根據血清型分布，計算多價疫苗 PCV7(4、6B、9V、14、18C、19F 和 23F)，PCV11(在 PCV7 基礎上增加 1、3、5、7)、PCV13(在 PCV11基礎上增加6A、19A)包含血清型的所占比率，即疫苗覆蓋率。

(二)藥敏試驗 采用E試驗法檢測8種抗菌藥物的最低抑菌濃度(MIC)，包括青霉素、阿莫西林-克拉維酸、頭孢克洛、頭孢呋辛、頭孢曲松、紅霉素、阿奇霉素和莫西沙星。操作按照藥敏試驗紙片生產廠家法國生物梅里埃公司產品說明進行。結果判斷依據為CLSI 2009年標準。每批藥敏試驗檢測均納入質控菌株肺炎鏈球菌ATCC 49619。

(三)統計學方法 采用WHONET 5軟件進行數據分析。有關率的比較采用卡方檢驗，P＜0.05提示差異有統計學意義。

結 果

一、肺炎鏈球菌血清型/群的分布

338株肺炎鏈球菌主要血清型依次為19F 138株(41.0%)、19A 67 株 (19.8%)、14 型 30 株(8.9%)、23F 14 株(4.1%)、6B 13 株(3.8%)、6A 12株(3.6%)和 15B 10 株(3.0%)。另有 3.8%(13/338)的菌株屬于其他血清型。12.0%(41/338)的菌株不能為所采用的方法明確分型。PVC7的覆蓋率58.9%，PVC13的覆蓋率84.3%。在青霉素不敏感肺炎鏈球菌(PNSP)和紅霉素耐藥肺炎鏈球菌(ERSP)中PCV7的覆蓋率分別為41.9%(26/62)和 59.6%(198/332)，PCV13 的覆蓋率分別為72.6%(45/62)和 84.9%(282/332)。2 歲以下嬰幼兒未分能型株為15.6%(30/192)，顯著高于2～5歲兒童7.5%(11/146)的比率(P ＜0.05)，其他血清型分布差異無統計學意義。肺炎鏈球菌的血清型分布見表1。

表1 肺炎鏈球菌的血清型分布［n(%)］Table 1.Distribution of serotypes of S.pneumoniae［n(%)］

二、肺炎鏈球菌對抗菌藥物的敏感性

338株肺炎鏈球菌中的PNSP(MIC＞2 mg/L)占 18.3%(62/338)，其中 40.3%(25/62)的菌株為PRSP(MIC ＞8 mg/L)，59.7%(37/62)的菌株為青霉素中介肺炎鏈球菌(PISP)。對阿莫西林-克拉維酸、頭孢曲松、頭孢克洛和頭孢呋辛的不敏感率依次為 36.2%、26%、92.6%和89.1%，對非 β 內酰胺類抗菌藥物紅霉素、阿奇霉素的不敏感率達98%以上，未發現對莫西沙星耐藥的菌株。統計學分析表明19F和19A血清型的PNSP菌株對阿莫西林-克拉維酸、頭孢曲松的耐藥率顯著高于PSSP菌株(P＜0.01)。未能分型的PNSP對阿莫西林-克拉維酸、頭孢曲松以及頭孢呋辛的耐藥率顯著高于PSSP(P＜0.01)。主要血清型的PNSP和PSSP菌株對8種抗菌藥物的藥敏試驗結果見表2。

表2 不同血清型肺炎鏈球菌對抗菌藥物的不敏感率(NS，%)Table 2.Nonsusceptible rate of Streptococcus pneumoniae to antibiotics by serotype(NS，%)

討 論

肺炎鏈球菌疫苗是預防其感染的重要手段，也是預防耐藥性擴散的措施之一［2］。適當的疫苗可預防90%以上的肺炎鏈球菌的侵襲性疾病，34%的中耳炎和11%～73%的肺炎，并可降低兒童鼻咽部肺炎鏈球菌的攜帶［3］。研究表明與疾病相關的血清型隨時間、地點、年齡不同而變化，Ho等［4］的研究提示香港地區肺炎鏈球菌主要的血清型為6B、19F、23F和14型，其PCV7的覆蓋率為66.5%，血清型種類在小于2歲和2～5歲兒童之間無任何差異。本研究分離到的血清型種類有13種，主要的血清型為19F、19A、14、23F、6B、6A、15B。PCV7 的覆蓋率58.9%，顯著低于本世紀初。趙根明等［5］研究提示PCV7覆蓋率在上海兒童人群中可高達81%。在本研究中PNSP的判斷標準采用CLSI 2008年版的新規，其所占的比率較2007年的90%有大幅度下降，僅為18.3%，其血清型種類主要為19F、19A和未能分型3種，占88.7%，與姚開虎等［6］報道的PNSP的血清型以 19、23、6、14 和不能分型為主、Richter等［7］報道美國的 PNSP 菌株血清型以 23、19、14、6和9為主更為集中，PCV7的覆蓋率41.9%，顯著低于對PSSP的覆蓋率(62.3%)。本組資料顯示19F和19A血清型的PNSP菌株對阿莫西林-克拉維酸、頭孢曲松的耐藥率顯著高于PSSP菌株(P＜0.01)。

本研究中，PCV7未覆蓋的19A型已達19.8%，成為第2位常見血清型。19A型菌株對β內酰胺類和大環內酯類抗生素表現出具有很高的耐藥性。Farrell等［8］報道2000—2004年在14歲以下兒童臨床分離株中，19A型所占比率由 4.7%升高到18.9%。Messina等［9］報道2002—2005 年在 5歲以下兒童侵襲性感染肺炎鏈球菌菌株中，19A型所占比率逐漸升高，分別為11.5%、16%、36%和44%。歐美國家使用PCV7后增加的19A型菌株的耐藥性也在增強［8-9］，提示19A型菌株的增多可能不只是推廣應用PCV7的結果，也可能與某些抗菌藥物的選擇性壓力有關。

PCV13是在 PCV7的基礎上增加了1、3、5、6A、7F和19A型，覆蓋了具有較強耐藥性的19A型。本研究中PCV13在338株肺炎鏈球菌中覆蓋率達84.3%，在62株PNSP中覆蓋率為72.6%。在332株ERSP中覆蓋率為84.9%，應用該疫苗應可有效地預防兒童肺炎鏈球菌的感染和控制耐藥菌株傳播。

值得注意的是不能分型的菌株在本研究中占有相當的比率，在2歲以下嬰幼兒和PRSP菌株中，分別占15.6%(30/192)和 64.0%(16/25)，而且這些菌株對常用抗菌藥物表現出很高的耐藥性。不能分型的菌株是否同屬于某一或某幾個血清型，以及它們在細菌耐藥性傳播中所起的作用有待于進一步研究。

在廣泛使用疫苗后，歐美的監測研究表明，疫苗未覆蓋血清型菌株的感染發病率有持續上升趨勢，包括15A、23A、35B 以及不能分型的菌株［10］，這些菌株對常用抗生素具有較高的耐藥性，尤其是不能分型菌株。因此，我們在應用疫苗預防肺炎鏈球菌疾病的同時，應加強耐藥性監測，指導臨床合理使用抗生素，以減少抗生素選擇性壓力下疫苗未覆蓋血清型肺炎鏈球菌耐藥株的傳播流行。

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