磁共振成像及對比劑在細胞移植中的研究進展

徐 波，梁碧玲，鄧宇斌*

細胞移植(cell transplantation)是將自體細胞或異體細胞經體外擴增或分化培養后再移植入動物體特定部位的技術，主要應用于細胞治療和科學研究中。隨著干細胞研究的不斷深入，移植干細胞通過分泌相關營養因子或定向分化更新病損組織的方式對特定疾病進行治療已成為近幾年的研究熱點[1]。將細胞移植入體內后，研究者需要一種有效的手段監測移植細胞在遷移、分布、功能分化等，為評價治療效果和研究作用機制提供依據。當細胞移植應用于臨床治療時，要求這種監測方法不能對患者造成二次損傷。磁共振成像技術 (magnetic resonance imaging,MRI)是利用人體組織中某種原子核的核磁共振現象，使用計算機輔助系統，將人體不同類型及不同生理狀態的組織進行成像的診斷技術，具有無輻射損傷、非侵入性、高敏感性、高分辨率并能對監測對象三維重構等優點，非常適合用于活體監測移植細胞[2]。MRI對比劑(contrast agents)，可使局部磁共振信號發生明顯變化。使用MRI對比劑對體外培養的細胞標記后進行細胞移植，可使用MRI對移植細胞實現連續多時間點監測。隨著磁共振細胞標記及細胞成像研究的發展，大量的相關研究成果被陸續報道，本文就目前研究最活躍的細胞標記用磁共振對比劑和相應的標記方法作一綜述。

對細胞進行磁共振對比劑標記，一方面對比劑的本身的特性決定了標記的效果，為了提高標記率，對比劑的分子量、電荷性及溶解性有嚴格限制。一般而言，分子量越小越則容易進入細胞質內。由于細胞膜表面帶有微弱的負電荷，所以如果對比劑本身帶有正電荷，則更容易吸附于細胞膜，有利于細胞標記。但如果對比劑表面帶有負電荷則會受到細胞表面負電荷的排斥，可以利于多種陽離子轉染試劑輔助進行標記。另一方面細胞自身的特性決定了標記難度，用于細胞移植的細胞主要有兩類，即免疫細胞和干細胞。相比之下一部分免疫細胞具有較強的吞噬能力，可以直接通過胞吞或胞飲的方式將對比劑吞入胞內完成標記，而干細胞則較難進行標記，通常需要使用輔助方法進行有效標記。

1 細胞標記對比劑

1.1 順磁性對比劑

這一類對比劑大多為鑭系元素螯合物，其中以釓螯合物居多，包括Gd-DTPA、Gd-DTPA-BMA、Gd-HP-DO3A等。Gd-DTPA于1987年即被美國FDA批準為第一種用于臨床診斷的磁共振對比劑。此類對比劑可在一定濃度范圍內使標記細胞在T1加權成像時造呈高信號[3]。較早的研究工作，以研究對比劑性能為主，2004年Crich等[4]分別用Gd-HP-DO3A 和Eu-HP-DO3A標記內皮祖細胞，銪(Eu)為鑭系元素，標記過程未使用其他輔助標記試劑。標記細胞中Gd濃度達到0.1 μmol/mg蛋白質。但將標記細胞移植入小鼠腎臟后，僅有Gd-HP-DO3A標記的細胞可以在MRI T1 WI呈高信號，信號增強效果可維持14天以上。同時發現標記后的內皮祖細胞具有良好的細胞活性，并保持有血管新生能力。研究者發現，某些細胞由于細胞類型的原因，很難使用順磁性對比劑直接標記，需要通過輔助標記方法進行有效標記，2006年Terreno等[5]應用電穿孔法和直接孵育標記法分別將Gd-HP-DO3A標記入大鼠肝癌細胞的細胞質中和內囊泡中，發現等量的Gd-HP-DO3A進入細胞質比進入細胞內囊泡能在MRI下造成更強的信號變化。隨著干細胞研究的發展，磁共振干細胞成像逐漸成為研究熱點，2008年本課題組鄧宇斌等，使用jet-PEI輔助Gd-DTPA成功標記骨髓間充質干細胞，通過細胞毒性測試等評價了標記過程的生物安全性，結果顯示標記過程對細胞的生理狀態沒有明顯影響，將標記細胞移植入大鼠脊髓損傷模型中，標記細胞在MRI T1WI呈高信號，可通過MRI對標記細胞進行示蹤研究[6]。

1.2 超順磁性對比劑

超順磁性對比劑主要為一類氧化鐵納米顆粒，直徑在20～150 nm之間。根據他們的粒徑可將其分為小型超順磁性氧化鐵顆粒(SPIOs)和超小型超順磁性氧化鐵顆粒(USPIOs)[7]，通常粒徑小于50 nm則被稱為USPIOs。此類對比劑通過使組織的T2弛豫時間明顯縮短，在T2WI上顯示為低或無信號，在體內與周圍組織形成對比成像，并且敏感性高于順磁性對比劑，在更低的標記濃度下就可以造成足夠的信號對比[8]。SPIOs自1996年即被美國FDA批準為第一種用于臨床診斷的此類磁共振對比劑。由于SPIO和USPIO表面帶有負電荷，與細胞膜表面負電荷具有一定的排斥作用，難以通過直接胞吞的形式進行細胞標記。通常使用帶正電荷的轉染試劑輔助進行細胞標記，可有效提高標記效果，并降低標記過程的細胞毒性[9-13]。王建東等構建鐵蛋白高表達細胞株，并使用SPIO標記細胞，發現高表達鐵蛋白可以提高標記效果，這可能是由于鐵蛋白可促進細胞攝取和儲存鐵原子；細胞移植后體內MRI結果表明高表達鐵蛋白可延長SPIO活體示蹤細胞的時間，這可能是鐵蛋白將細胞內降解的SPIO鐵原子作為額外鐵源進行攝取，從而增強磁共振信號[12]。目前，超順磁對比劑干細胞標記已有大量研究，Gonzalez-Lara等于2010年了使用MPIOs標記間充質干細胞(MSCs)原位移植入大鼠脊髓損傷模型損傷位點，并對移植細胞完成了長達6周的MRI追蹤，標記效果持續時間較理想[7]。本課題組也進行了類似實驗，但發現由于很多損傷會造成機體局部出血和水腫，而出血和水腫會在T2 WI下呈低信號，超順磁標記細胞在T2 WI下也呈低信號，兩者具有明顯的信號干擾，因此超順磁性標記物在某些損傷出血動物模型的應用不佳[6]。

1.3 氟磁共振對比劑

氟對比劑主要應用于19F磁共振，由于19F磁共振不同于1H磁共振，其掃描成像的對象是氟原子而不是氫原子。由于動物內不存在內源性的氟，因此19F磁共振僅能對氟對比劑標記的細胞進行成像，特異性更強，但由于動物體其他組織在19F磁共振下沒有信號，也就沒有任何背景，所以無法定位，需要配合1H磁共振影像重疊進行定位[14]。2005年，Ahrens等使用全氟聚醚(PFPE)及轉染試劑lipofectamine標記大鼠樹突細胞，定量核磁共振分析表明單獨使用PFPE進行標記組，標記細胞內PFPE濃度達到0.25 ng/cell。但隨著細胞增殖，標記細胞內的PFPE隨時間逐漸降低，體外培養5天后，胞內PFPE濃度減少85%。研究者將PFPE標記的細胞移植入大鼠體內，使用19F磁共振和1H磁共振分別成像后疊加圖像，實現了對標記細胞的定位示蹤并觀察到移植細胞在體內遷移情況[15]。

2 標記方法分類

2.1 直接胞吞或胞飲的方式

胞吞或胞飲的方式主要用于標記免疫細胞，例如巨噬細胞、樹突細胞等。這類細胞具有很強的吞噬能力，可以通過吞噬作用直接將對比劑顆粒吞入細胞質中，并不需要其他輔助標記方法。Rausch和Saleh 等分別使用USPIOs成功標記巨噬細胞，在腦梗大鼠模型中使用MRI監測到標記后的巨噬細胞[16,17]。de Vries等在人體上使用SPIOs標記樹突細胞，在MRI下檢測到標記細胞的遷移和分布，并證明了SPIOs標記的安全性[18]。另外Himmelreich等使用可被脂肪酶部分分解的可激活對比劑Gd-DTPA-FA標記樹突前體細胞，標記完成后該對比劑處在失活狀態，只有當樹突細胞分化成熟并分泌脂肪酶后這種對比劑才能被激活進而引起磁共振信號變化，因此實現了通過磁共振監測細胞功能狀態的目的。但是，Gd-DTPAFA顆粒較大，目前僅適合標記樹突細胞[19]。

雖然干細胞普遍不具有吞噬能力，但也有研究證實可通過直接胞吞的方式對干細胞進行磁共振對比劑標記。Jendelová等用含有SPIOs的培養基孵育小鼠胚胎干細胞，并未采用其他輔助標記方法，普魯士藍染色和電子顯微鏡鏡檢證實SPIOs成功標記入干細胞，后移植入大鼠腦中，MRI檢測到移植細胞的遷移和分布，標記效果可維持50天[20]。

內源性免疫細胞同樣具有很強的吞噬能力，使得內源性免疫細胞可以吞噬組織間隙中的對比劑，這些組織間隙中的對比劑可以是通過靜脈注射的對比劑，也可以是標記細胞移植入體內后隨著分裂、死亡等生理過程釋放到組織間隙中的對比劑。當內源性的免疫細胞吞噬這些對比劑后，可能在MRI上產生假陽性，使研究者無法正確分辨移植細胞和內源性免疫細胞[3,21]。

2.2 轉染試劑輔助標記

許多干細胞無法通過用單獨含對比劑的培養基簡單孵育的方式進行標記。針對這點，目前許多研究者使用轉染試劑輔助進行磁性標記，使用較多的轉染試劑主要分為兩類。一類為陽離子物質轉染試劑，如多聚左旋賴氨酸(PLL) 、硫酸魚精蛋白等；另一類為脂質體轉染試劑。其工作原理都是依靠吸附作用使轉染試劑與對比劑結合后，共同進入靶細胞內。陽離子物質轉染試劑主要依靠刺激細胞膜促進胞吞，而脂質體轉染試劑則主要依靠與胞膜融合將包裹的對比劑遞送入細胞內。

SPIOs表面帶有負電荷，無法有效吸附到細胞膜上，Arbab等使用魚精蛋白在體外將SPIOs的標記入人骨髓間充質干細胞和CD34+造血干細胞中實現MRI監測，標記效果在CD34+造血干細胞中達到2.01±0.1 pg/細胞，在骨髓間充質干細胞中達到10.94±1.86 pg/細胞，并證實這種標記方法不會引起明顯的細胞毒性，標記細胞的增殖和分化能力沒有明顯改變[22]。van den Bos等分別單獨使用SPIOs或使用脂質體輔助SPIO對細胞進行標記，發現為了達到相同的有效標記濃度，不使用轉染試劑標記組所需的SIPOs濃度是使用轉染試劑標記組的100倍，且由于SPIOs濃度過高引起細胞內的自由基生成增加，對細胞產生明顯毒副作用[23]。

2.3 受體介導的胞吞方式

采用受體介導的胞吞方式進行細胞標記，需要對對比劑進行局部修飾，針對目的細胞的特異受體，在對比劑上連接可與這些受體特異結合的基團，以達到提高轉染效率的目的。目前主要選用的多為干細胞膜上的轉鐵蛋白受體，在對比劑上共價結合轉鐵蛋白后與細胞進行孵育進行轉染。1998年，Moore等首次構建了含有轉鐵蛋白基團的氧化鐵顆粒后，用這種特異對比劑標記干細胞，其轉鐵蛋白基團會和干細胞細胞膜上的轉鐵蛋白受體特異性結合，引起局部細胞膜內陷，進而形成內飲泡，將受體-轉鐵蛋白-氧化鐵顆粒轉運入細胞內，受體與轉鐵蛋白-氧化鐵顆粒分離后，返回細胞膜，而將轉鐵蛋白-氧化鐵顆粒則留在細胞內，可供MRI檢測[24]。任靜等構建前列腺干細胞抗原(PSCA)特異性MR分子探針7F5@GoldMag用于體外前列腺癌細胞MR成像，實現了對前列腺細胞的高效特異性標記，而對照組中使用7F5@GoldMag標記物對肝癌細胞無法進行有效標記[25]。

2.4 電穿孔等物理方法

電穿孔是功能強大轉染技術，可將核酸、蛋白及其他分子導入多種細胞。通過高強度的電場作用，瞬時提高細胞膜的通透性，從而吸收周圍介質中的外源分子。這種技術可以將核苷酸、DNA 與RNA、蛋白、糖類、染料及病毒顆粒等導入原核和真核細胞內。Geninatti等使用電穿孔方法將質粒DNA和Gd-DOTA-spd共同轉入干細胞內，通過免疫組化和MRI共同證實了此方法對干細胞標記的有效性[26]。Walczak等使用130 V和17 ms的電脈沖條件將菲立磁顆粒轉染入骨髓間充質干細胞和神經干細胞，并證實電穿孔標記法對干細胞分化能力沒有明顯影響[27]。Terreno等[5]，應用電穿孔方法將Gd-HPDO3A標記入大鼠肝癌細胞的細胞質中，并采用直接孵育法將Gd-HP-DO3A標記入大鼠肝癌細胞的內囊泡中，發現等量的Gd-HP-DO3A進入細胞質比進入細胞內囊泡能在MRI下造成更強的信號變化，其認為對比劑在細胞內分布的均勻程度影響MRI信號變化的幅度。

3 展望

MRI監測移植細胞要求細胞內對比劑濃度達到一定劑量，為了提高被標記細胞中磁共振對比劑的濃度，最簡單的辦法就是在標記的過程中增大對比劑的用量或者延長標記時間，但是這都將造成較強的細胞毒性，降低細胞的活力、增殖力以及分化能力，直接影響到細胞移植后的治療效果。而且，某些情況下提高對比劑濃度并不一定能有效提高標記效果。較早的研究已經總結出了各類常用對比劑在不引起明顯細胞毒性的范圍內所能使用的最高劑量和最長標記時間。隨后研究者將目光集中于開發新型對比劑和輔助標記方法，如輔助轉染試劑、對比劑表面靶向修飾等，通過這些方法，研究者已經可以對多種較難標記的細胞實現在低毒甚至無毒的條件下完成標記。通過以上努力，研究者實現了通過MRI監測移植細胞的遷移與分布的目的。但隨著移植細胞的凋亡、增殖或其他生理活動，細胞中的部分對比劑會釋放到組織間隙或其他內源性細胞中引起假陽性，這一問題仍待解決。事實上，目前更多的研究集中于監測移植細胞在體內功能狀態的變化，本文作者所在課題組現在也在進行此類研究。此類研究主要以兩種策略為主，既基因表達報告標記物策略和酶解激活報告標記物策略。細胞功能狀態的改變實際上是由某些特定基因表達的變化引起的，針對這些基因及其下游表達產物設計可調控對比劑，就可以實現依靠特定基因的表達控制對比劑的活性，只有特定基因表達后對比劑才被激活，才能引起MRI信號變化，從而實現通過MRI監測細胞功能狀態的目的。本課題組正在進行新型基因表達報告標記物的研究工作，預期通過MRI監測移植干細胞在體內定向分化的過程。

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