3T3-L1脂肪細胞與胰島素抵抗脂肪細胞miRNAs表達譜的差異性分析*

凌宏艷，胡 弼，庹勤慧，劉 剛，奉水東，朱炳陽，廖端芳

（1.南華大學醫學院 生理學教研室，湖南 衡陽 421001；2.南華大學藥物藥理研究所 藥理學教研室，湖南 衡陽 421001；3.南華大學公共衛生學院 流行病教研室，湖南 衡陽 421001；4.湖南中醫藥科大學藥學院，湖南 長沙 410208）

2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）是一個全球性的和嚴重的慢性疾病，遺傳和環境等因素的改變可導致T2DM的發生。T2DM發病機制的兩個基本環節是胰島素抵抗（insulin resistance，IR）和胰島素分泌不足，其中，IR貫穿了T2DM發生發展的全過程[1]。因此，探討IR發生的分子機制是控制和改善IR以及預防和治療糖尿病等代謝綜合征最根本的途徑。微小 RNA（microRNA，miRNAs）是新近證明的一類高度保守的、內源性非蛋白編碼的和長度為20～25 nt的小分子RNA，在轉錄后水平調節基因的表達[1]。近年來研究表明，miRNAs參與調控細胞的眾多生物學過程，如脂肪細胞分化[2-4]、糖脂代謝[5]、能量的穩態[6]和胰島素的產生和分泌[7-8]等，這些研究提示，miRNAs作為代謝性通路中新發現的調節因子，可能調節哺乳動物中與IR相關的代謝過程。因此，為探討miRNAs在IR中的調控作用，本研究主要采用miRNAs芯片技術，分析比較了脂肪細胞和IR脂肪細胞中差異表達的miRNAs，篩選出與IR相關的miRNAs，并預測某些miRNAs可能調控的靶基因，為闡明IR的致病機制及其防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

DMEM培養基、胰蛋白酶和胎牛血清均購于美國Gibco公司；分化誘導劑1-甲基-3-異丁基黃嘌呤（1-methyl-3-isobuthylxanthine，IBMX）、地塞米松（dexamethasone，DEX）、胰島素和2-脫氧葡萄糖均購于美國Sigma公司；3T3-L1前脂肪細胞株購于美國ATCC公司；Trizol和實時定量PCR試劑盒購自Invitrogen公司；2-脫氧-[3H]-D葡萄糖購于Amersham公司，余為國產分析純。

1.2 主要方法

1.2.1 3T3-L1前脂肪細胞誘導分化 3T3-L1細胞以L-DMEM含10%新生小牛血清在37℃和5%二氧化碳的條件下培養。待細胞生長至完全融合后2 d（第0天）時開始誘導分化，將培養液換成含10%胎牛血 清、0.5 mmol/L IBMX、10μg/mL 胰島素和1.0μmol/L Dex的L-DMEM刺激，2 d后換用只含10μg/mL胰島素和10%胎牛血清的L-DMEM培養2 d，隨后每2天換用含10%胎牛血清的L-DMEM，至第9天用顯微鏡觀察。

1.2.2 實時熒光定量PCR檢測脂肪酸結合蛋白（adipocyte fatty acid binding protein 2，aP2）和過氧化物增殖體激活物受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor，PPARγ）的表達 用Trizol提取總RNA，將1μg的總RNA逆轉錄成第1鏈cDNA，以第1鏈cDNA為模板進行PCR擴增。PCR反應引物如下：aP2：5'-CATGGCCAAGCCCAACAT-3'（正義），5'-CGCCCAGTTTGAAGGAAATC-3（'反義）；PPARγ：5'-CGCTGATGCACTGCCTATGA-3（'正義），5'-AGAGGTCCACAGAGCTGATTCC-3（'反義）；βactin：5'-TGTCCACCTTCCAGCAGATGT-3'（正義），5'-AGCTCAGTAACAGTCCGCCTAGA-3（'反義）。熒光定量PCR的擴增參數如下：94℃預變性3 min；95℃變性 30 s、58℃復性 30 s、72℃延伸 40 s（45 個循環）；95℃ 1 min；55℃ 1 min；55℃ 10 s（80 個循環）；降溫至4℃保存，得到熒光定量PCR的擴增動力曲線。根據LIVAK等[9]采用的FQ-RT-PCR的相對定量（2-ΔΔC）t方法，來比較目的基因在不同細胞中的表達差異。

1.2.3 3T3-Ll IR脂肪細胞的誘導 將6孔培養板中分化成熟的3T3-L1脂肪細胞用含5.5 mmol/L葡萄糖的10%胎牛血清培養2 d。為誘導IR，脂肪細胞分成兩組：正常葡萄糖正常胰島素組（對照組），用含5.5 mmol/L葡萄糖的10%胎牛血清DMEM培養液培養；高葡萄糖高胰島素組（IR組），用25 mmol/L葡萄糖和高胰島素液（1μmol/L）處理脂肪細胞24 h。

1.2.4 葡萄糖攝取實驗 將6孔板中的脂肪細胞以含0.2%BSA的DMEM培養液培養2 h后，用KRPB緩沖液洗滌3遍，再以含或不含100 nmol/L胰島素的KRPB緩沖液37℃孵育30 min，加入1 mL含 0.5μCi/mL 2-脫氧 -[3H]-D葡萄糖和 0.1 mmol/L 2-脫氧葡萄糖的KRPB緩沖液37℃孵育10 min。以10μmol/L的細胞松弛素B作為對照，計算細胞對標記葡萄糖的非特異性攝取。細胞用冰冷的含10 mmol/L葡萄糖的PBS快速洗3次終止反應，每孔加入1 mL 0.1 mol/L的NaOH作用20 min，取細胞消化液，加入到4 mL閃爍液中。在液體閃爍計數器中檢測樣品的每分鐘衰變數，各數據均減去葡萄糖的非特異性攝取值作為各組細胞的葡萄糖攝取量，每次實驗設3個復孔，共重復3次實驗。

1.2.5 miRNA芯片分析 本實驗將Trizol處理的3T3-L1脂肪細胞和IR脂肪細胞交至上海康成生物公司進行miRNA芯片雜交。基因表達譜芯片的檢測步驟包括總RNA的提取與鑒定、miRNA標記和miRNA芯片雜交等步驟，最后芯片掃描獲得TIFF圖后，使用Genepix Pro6.0軟件分析數據，以芯片中的內對照熒光值為參照，分別計算實驗組和對照組的標準值；隨后計算IR脂肪細胞中每一個miRNA的表達水平和脂肪細胞同一個miRNA的表達水平，兩者之比即為改變的倍數。

1.2.6 生物信息學分析 根據基因芯片的結果，對顯著變化的2個miRNAs進行分析，主要通過3個生物信息學預測網站（TargetScan、miRanda和miRBase），取至少2個軟件預測到的基因作為靶基因。

1.3 統計學分析

所有數據采用SPSS11.0軟件包進行分析，以均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，檢驗水準為α=0.05。

2 結果

2.1 3T3-L1前脂肪細胞誘導分化成成熟脂肪細胞

誘導分化前的3T3-L1前脂肪細胞形態與成纖維細胞相似，呈典型的梭形，胞漿中未見脂滴，見圖1A；至誘導分化第9天時，90%以上的3T3-L1前脂肪細胞分化為成熟的脂肪細胞，表現為細胞漿豐富，大量的體積較大的脂滴分布于細胞核周圍，形成“戒環樣”結構，即為典型的成熟脂肪細胞形態，見圖1B。熒光定量PCR結果顯示：3T3-L1前脂肪細胞用分化誘導液處理后，aP2和PPARγ mRNA的表達水平顯著升高，見圖1C、D。

2.2 IR脂肪細胞模型的建立

圖2顯示，基礎狀態下，3T3-L1脂肪細胞經高葡萄糖和高胰島素處理24 h后，葡萄糖攝取率無顯著改變；而在胰島素存在情況下，3T3-L1脂肪細胞對葡萄糖攝取率明顯增加，約為基礎狀態下的4.2倍；高葡萄糖和高胰島素使3T3-L1脂肪細胞的葡萄糖攝取率由（419.0±19.2）%下降到（258.0±17.3）%（P＜0.01），提示高葡萄糖和高胰島素聯合培養脂肪細胞可誘導IR脂肪細胞模型成立。

圖1 3T3-L1前脂肪細胞誘導分化成成熟脂肪細胞

圖2 高葡萄糖高胰島素對3T3-L1脂肪細胞3H葡萄糖攝取的影響 （n=3）

2.3 miRNAs基因芯片雜交的結果

圖3 miRNA表達譜代表圖

來自3T3-L1脂肪細胞和IR脂肪細胞的總RNA經純化和Cy3熒光標記后，同miRNA芯片進行雜交，使用Genepix 4000B在635 nm通道處對雜交后的芯片進行圖像掃描，結果如圖3所示。應用Genepix Pro 6.0軟件分析所得數據，得到上調或下調超過2倍差異表達的miRNAs共79個：其中，表達水平降低50%以上者（表達下調）共29個，且miR-21下降最明顯；表達水平升高2倍以上者（表達上調）共50個，且miR-320上調最明顯。

2.4 靶基因的預測

本實驗選擇IR脂肪細胞中顯著下調的miR-21和顯著上調的miR-320進行靶基因預測。通過3個靶點預測軟件（TargetScan、miRanda和miRBase）預測miR-21和miR-320可能的靶基因，為了減少假陽性率，挑選至少出現在2個軟件中的基因作為其可能的靶基因。共篩選出與IR或糖尿病相關的靶基因13個，其中miR-21有7個；miR-320有6個。見附表。

附表 miR-21和miR-320與胰島素抵抗或糖尿病相關的靶基因

3 討論

研究表明，miRNAs表達的異常與IR和糖尿病密切相關。ESAU等[4]將反義miR-122注入小鼠體內導致血漿三酰甘油降低，進一步將小鼠的肝細胞取出培養發現，肝臟脂肪酸和固醇的合成減少，脂肪酸的氧化增加，表明miR-122調節小鼠的脂代謝。XU等[5]研究發現，miR-14缺失的果蠅體內三酰甘油和二酰甘油的水平提高，然而增加miR-14的表達則會產生相反的結果，說明miR-14是脂肪代謝的一個負性調控因子。TELEMAN等[7]報道，miR-278缺失的突變型果蠅有胰島素生成增加、體重降低和血糖升高的變化；增加miR-278的表達可使上述指標得以恢復，這一實驗首次表明改變體內miRNAs的表達對IR具有調節作用。WANG等[10]報道，miR-320可促進糖尿病大鼠的血管新生；HE等[11]發現，糖尿病小鼠的miR-29高度上調，將miR-29轉染給3T3-L1細胞，可抑制胰島素誘導的葡萄糖攝取。這些研究提示，miRNAs作為代謝性通路中新發現的調節因子，可能調節與IR相關的哺乳動物的代謝過程。如果能找到對IR調控的miRNAs，必將對IR和糖尿病等代謝相關性疾病的治療提供一個新的基于RNA治療的藥物靶點。

3T3-L1脂肪細胞是來源于小鼠胚胎成纖維細胞、經克隆擴增而成的前脂肪細胞系，是在體外被廣泛應用于脂肪細胞功能研究和IR發病機制研究的重要細胞模型。本實驗通過經典的“雞尾酒”法誘導3T3-L1脂肪細胞的形成，隨后用高葡萄糖和高胰島素處理脂肪細胞24 h，通過葡萄糖攝取實驗進行驗證。發現高葡萄糖和高胰島素誘導脂肪細胞24 h，可明顯抑制脂肪細胞對培養基中葡萄糖的攝取，提示高葡萄糖和高胰島素可誘導脂肪細胞產生IR，從而為下一步的芯片實驗奠定了基礎。

miRNA芯片技術是一種快速有效地分析miRNA表達譜的方法，該方法可以更好地了解miRNAs的整體表達情況。本研究中，以miRNA芯片技術為平臺，檢測了脂肪細胞和IR脂肪細胞的miRNAs表達譜，篩選得到差異表達的miRNAs共79個：其中29個表達下調，且miR-21明顯下降；50個表達上調，且miR-320明顯上調。可見，在IR脂肪細胞中明顯上調的miRNAs基因在數量上超過了在脂肪細胞中明顯下調的miRNAs基因。

本研究采用的是丹麥Exiqon公司8.0版的小鼠miRNAs芯片。該芯片上固定的探針包括與人（328個）、小鼠（274個）和大鼠（238個）的miRNAs精確配對的探針、對照探針以及錯配探針，可以檢測Sanger miRBase數據庫8.0版中所有已知的人、小鼠、大鼠和其他物種的miRNAs，代表性好；同時能夠高靈敏和高特異性地檢測miRNAs的表達，準確檢測樣品中所有miRNAs的表達水平；且每張芯片對同一樣品重復4次檢測，進一步提高了芯片的可靠性。因此，本研究篩選到的差異表達的miRNAs將為進一步研究miRNAs在IR形成中的調控作用提供了較多和較可靠的依據。

目前，在動物體內只有小部分miRNAs的生物學功能得到了闡明，絕大多數miRNAs的具體功能仍然不清楚，主要是由于在特定的狀態下尋找miRNAs調控的靶基因存在一定的困難。生物信息學預測靶基因是miRNAs功能研究的重要方法，為此筆者對顯著下調的miR-21和顯著上調的miR-320進行靶基因預測，以求進一步理解他們與IR或糖尿病的關系。結果表明，miR-21的靶基因包括胰島素信號相關基因PIK3R1和PPP1R3B、脂代謝相關基因PPARA以及細胞增殖相關基因TGFBI、TGFBR2、TIMP3和MAP3K1等；miR-320的靶基因主要為胰島素信號相關基因 PTEN、PIK3R1、IGF2BP3、IGF1R和IGF1。上述結果提示這些miRNA的作用靶點廣泛，涉及胰島素的信號轉導、脂代謝和細胞增殖等相關基因，由此說明：某些關鍵miRNAs表達水平的失衡可能是導致IR和糖尿病等代謝性疾病發生和發展的重要原因；同時也說明miRNA靶基因預測為進一步研究miRNA在IR和糖尿病發生中的作用機制提供了重要線索。

綜上所述，本研究率先以miRNAs芯片技術對脂肪細胞和胰島素抵抗脂肪細胞的miRNAs表達譜進行研究，經過分析比較發現29個下調和50個上調的miRNAs，靶點預測顯示miR-21和miR-320的靶點非常廣泛，為進一步研究它們的功能奠定了基礎。

[1]DAS SK,ELBEIN SC.The genetic basis of type 2 diabetes[J].Cellscience,2006,2(4):100-131.

[2]BARTEL,DP.MicroRNAs:genomics,biogenesis,mechanism,and function[J].Cell,2004,116(2):281-297.

[3]WANG Q,Li YC,WANG JH,et al.miR-17-92 cluster accelerates adipocyte differentiation by negatively regulating tumor-suppressor Rb2/p130[J].PNAS,2008,105(2):2889-2894.

[4]ESAU C,DAVIS S,MURRAY SF,et al.MiR-122 regulation of lipid metabolism revealed by in vivo antisense targeting[J].Cell Metab,2006,3(2):87-98.

[5]XU P,VERNOOY SY,GUO M,et al.The Drosophila microRNA mir-14 suppresses cell death and is required for normal fat metabolism[J].Current Biology,2003,13(9):790-795.

[6]POY MN,SPRANGER M,STOFFEL M.MicroRNAs and the regulation of glucose and lipid metabolism [J].Diabetes Obes Metab,2007,9(Suppl 2):67-73.

[7]TELEMAN AA,COHEN SM.DrosophilalackingmicroRNA miR-278 are defective in energy homeostasis[J].Genes&Dev,2006,20(4):417-422.

[8]BAROUKHN,RAVIERMA,LODERMK,etal.MicroRNA-124a regulates Foxa2 expression and intracellular signaling in pancreatic β-Cell Lines[J].J Biol Chem,2007,282(27):19575-19588.

[9]LIVAK KJ,SCHMITTGEN TD.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2[-Delta Delta C(T)]method[J].Methods,2001,25(4):402-408.

[10]WANG XH,QIAN EZ,ZHANG W,et al.MicroRNA-320 expression in myocardial microvascular endothelial cells and its relationship with insulin-like growth factor-1 in type 2 diabetic rats[J].Clin Exp Pharmacol Physiol,2009,36(2):181-188.

[11]HE A,ZHU L,GUPTA N,et al.Overexpression of micro ribonucleic acid 29,highly up-regulated in diabetic rats,leads to insulin resistance in 3T3-L1 adipocytes[J].Mol Endocrinol,2007,21(11):2785-2794.