血管性癡呆小鼠海馬神經(jīng)細胞鈣穩(wěn)態(tài)及石杉堿甲的影響

王偉斌

隨著高齡人口和腦卒中存活率的增高，血管性癡呆(VD)的發(fā)病愈來愈多。由于生理濃度的鈣離子作為神經(jīng)細胞內(nèi)第二信使，參與了學習和記憶過程;因此，神經(jīng)細胞［Ca2+］i研究一直倍受人們關注。

1 材料與方法

1.1 動物模型制備與分組 實驗動物選用2月齡雄性昆明小鼠。采用雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎再灌注的方式制備VD模型;假手術組僅暴露雙側(cè)頸總動脈;治療組先制備模型，術后第2天給予石杉堿甲0.05 μg/g/d 30 d。

1.2 學習、記憶成績測試 跳臺試驗裝置為被動回避反應箱，術后第29天測試學習成績，記錄動物反應時間、錯誤次數(shù);24 h后測試記憶成績(潛伏時間及錯誤次數(shù))。

1.3 LSCM下觀察神經(jīng)細胞靜息態(tài)［Ca2+］i及其去極化興奮時的鈣震蕩 將小鼠斷頭處死，在低溫下分離出海馬組織，制備海馬活細胞。滴加熒光探針Fluo-3(濃度1000 mM)1 μl，在Bio-Rad MRC-1024型LSCM下，對錐體細胞進行激光掃描觀察，數(shù)據(jù)為細胞內(nèi)熒光像素的相對值;觀察靜息態(tài)［Ca2+］i后，加入20 μl 50 mmol/L氯化鉀溶液，觀察神經(jīng)細胞的鈣震蕩變化，記錄其［Ca2+］i的上升時間、下降時間以及升高的峰值和幅度。

1.4 數(shù)據(jù)分析 采用單因素方差分析，運用SAS軟件進行處理，并采用SNK法進行3組之間的兩兩比較。

2 結(jié)果

2.1 跳臺試驗 表1可見，模型組的學習成績和記憶成績均劣于假手術組，治療組的學習成績和記憶成績均優(yōu)于模型組。

2.2 海馬神經(jīng)細胞鈣穩(wěn)態(tài)變化 表2可見，模型組靜息態(tài)［Ca2+］i顯著高于假手術組、治療組，并且去極化后海馬神經(jīng)細胞［Ca2+］i升高幅度明顯降低，恢復時間明顯延長。

表1 各組小鼠學習和記憶成績比較

表2 海馬神經(jīng)細胞［Ca2+］i熒光像素相對值比較

2 討論

VD是因腦血管疾病所致的認知功能障礙綜合征。近幾年來，對其發(fā)病機制及治療的研究愈來愈多。本實驗采用雙側(cè)頸總動脈線結(jié)法造成腦組織反復缺血-再灌注損傷，并且經(jīng)行為學測試存在學習和記憶功能障礙，是比較理想的血管性癡呆動物模型。

VD小鼠海馬神經(jīng)細胞鈣穩(wěn)態(tài)失衡，表現(xiàn)為：靜息態(tài)［Ca2+］i升高，去極化時升高幅度降低、恢復時間延長。與小鼠學習和記憶成績降低相一致，可能參與了VD的分子生物學發(fā)病機制。靜息態(tài)［Ca2+］i升高可以促進神經(jīng)元凋亡或遲發(fā)性壞死，進而降低了海馬參與學習和記憶的功能［1］。同時，海馬神經(jīng)細胞靜息態(tài)［Ca2+］i過高可能升高了突觸傳遞的閾值，易化突觸的抑制，降低突觸傳導、神經(jīng)遞質(zhì)釋放、信號轉(zhuǎn)導等，從而導致了學習記憶功能障礙。去極化時［Ca2+］i升高幅度降低反映了Ca2+內(nèi)流減少，降低了突觸后神經(jīng)細胞內(nèi)Ca2+引起的激酶激活及參與學習和記憶的基因轉(zhuǎn)錄，降低了神經(jīng)遞質(zhì)和突觸素的合成，導致LTP的誘導和維持障礙，出現(xiàn)學習和記憶功能受損［2］。并且，VD小鼠海馬神經(jīng)元受刺激后，［Ca2+］i持續(xù)升高，恢復到靜息態(tài)水平的時間較長，從而使細胞凋亡基因的啟動、突觸傳遞的閾值升高、鈣依賴性激酶的激活減少等進一步加重。至于石杉堿甲改善VD海馬神經(jīng)細胞鈣穩(wěn)態(tài)的機理尚在探討中。有學者研究，石杉堿甲具有神經(jīng)細胞NMDA受體拮抗作用，并且這種作用與其膽堿酯酶抑制作用無關系;其與非競爭性NMDA受體拮抗劑MK-801的作用沒有明顯差別［3］。Gordon等進一步研究，石杉堿甲通過NMDA受體拮抗作用減輕興奮性氨基酸的毒性及繼發(fā)的Ca2+內(nèi)流，從而減輕缺血缺氧引起的神經(jīng)元變性、壞死;這種作用對M型或N型乙酰膽堿受體及腺苷受體無影響［4］。

因此，我們認為：在石杉堿甲的治療作用下，VD海馬神經(jīng)細胞鈣穩(wěn)態(tài)受缺血缺氧影響不明顯，從而可以維持鈣穩(wěn)態(tài)于正常水平，使神經(jīng)細胞及其生理功能免于損傷。

［1］Saski C，Kitagawa H.Temporal profile of cytochrome C and caspase-3 immunoreactives and TUNEL staining after permanent middle cerebral artery occlusion in rats.Neurol Res，2000，22(2)：223-228．

［2］徐虹．韓太真與長時程增強相關的基因表達的研究進展生理科學進展，2001，32(2)：174-176．

［3］hang YH，Chen XQ.Similar potency of the enantiomers of huperzine A in inhibition of［(3)H］dizocilpine(MK-801)binding in rat cerebral cortex.NeurosciLett，2000，295(3)：116-118．

［4］gordon RK，Nigam SV.The NMDA receptor ion channel：a site for binding of Huperzine A.J ApplToxicol，2001，21(Suppl 1)：47-51．