編碼酶復合體I亞單位的線粒體基因新突變導致的MELAS綜合征

趙丹華， 王朝霞， 李務榮， 洪道俊， 鄭日亮， 孫永安， 張 巍， 袁 云

酶復合體I(NADH:泛醌氧化還原酶)是線粒體呼吸鏈的第一個酶復合物，其功能是催化一對電子從NADH傳遞給泛醌，在整個呼吸鏈的電子傳遞及能量代謝過程中發揮關鍵作用。酶復合體I也是呼吸鏈中最大、結構最復雜的一個蛋白復合物，主要由40余個亞單位組成，其中包括7個由線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)編碼的NADH 脫氫酶(NADH dehydrogenase，ND)亞單位，即 ND1-ND6 和ND4L，以及至少 38 個由核基因編碼的亞單位［1，2］。編碼ND亞單位的mtDNA(即ND基因)突變多出現在Leigh綜合征(Leigh syndrome，LS)以及 Leber視神經病患者中。但是，線粒體病的基因型和臨床表型之間常表現出明顯的異質性。近年來，國外相繼報道了多例ND基因突變導致的線粒體腦肌病伴高乳酸血癥和中風樣發作(mitochondrial encephalomyopathy with lactic academia and stroke-like episodes，MELAS)患者［3～7］。我們在報道了 ND5亞單位編碼區最常見的突變-G13513A突變后［8］，最近又發現了4例由ND基因的新/罕見突變導致的MELAS綜合征患者，在此報道其臨床、骨骼肌病理改變特點和基因分析結果。

1 對象與方法

1.1 研究對象 4例患者的臨床表現均高度提示線粒體腦肌病或腦病。經聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)方法檢測這4例患者的肌肉、外周血和(或)尿液組織的mtDNA的常見突變位點(包括 A3243G、T3271C、A8344G、T8993C/G、G13513A)均為陰性。

患者1，女，19歲。自11歲后開始反復發作伴視覺先兆的偏頭痛，16歲時出現肌陣攣癲癇，間斷有四肢強直-陣攣發作，19歲時因突發雙眼視物模糊伴雙側聽力輕度下降入院。家族史陰性。體格檢查:神志清楚，言語流利，雙眼皮質盲，雙耳聽力略減退，伸舌右偏，四肢肌力5級，右側Babinski征陽性。靜態血乳酸4mmol/L(正常值0.5～2mmol/L)。發病以來多次行頭部MRI檢查示雙側頂、枕葉皮質不對稱異常信號及雙側基底節、腦干對稱異常信號(圖1A，B)。腰穿腦脊液檢查及腦血管造影檢查均未見異常。

患者2，男，31歲。在21歲時于車禍后出現一過性意識障礙，1個月后，患者突發左顳部頭痛伴偏盲、失語及失讀，頭CT示左側枕葉低密度灶。此后患者出現反復的卒中樣發作，伴隨難治性癲癇、反應遲鈍以及人格改變。家族中無類似患者。體格檢查:神志清楚，感覺性失語，右側中樞性舌癱，四肢肌力5級，肌張力稍高，雙側Babinski征陽性。靜態血乳酸4.2mmol/L。頭部MRI顯示雙側頂、枕、顳葉多發病灶，頭部MRA未見異常。

患者3，女，13歲。足月順產，自幼運動發育正常。6歲時出現雙眼視力下降，當時診斷為球后視神經炎，予激素治療1個月后視力基本恢復。10歲后逐漸出現雙眼斜視。11歲時于發熱后出現易驚嚇及行為異常。當時頭MRI示雙側基底節及中腦背側對稱性異常信號，左側顱中窩蛛網膜囊腫(圖1C，D)。12歲出現行走時左上肢向后背伸，雙腿屈曲。入院前3個月突發偏頭痛、癲癇發作、視力下降及右側同向性偏盲。家族史陰性。入院查體:身材瘦小，軀干及四肢毛發明顯增多，背部毛發呈旋渦狀改變。左足內翻畸形，雙足跟腱攣縮。神志清楚，輕度構音障礙，眼底視乳頭邊清，色略蒼白。雙眼球外斜位，雙眼內收略差，雙側瞳孔等大等圓，對光反射遲鈍，輻輳反射消失。右側中樞性面癱。四肢一般性力弱，左上肢肌張力稍高，右上肢肌張力稍低。雙手輪替動作笨拙。雙側Babinski征陽性。靜態血乳酸2.9mmol/L。入院后頭MRI示雙側基底節、中腦及左枕葉異常信號(圖1E，F)。

患者4，女，28歲。自幼智力及運動發育輕度落后。8歲時出現血尿、蛋白尿，24歲時發現左腎萎縮。此后逐漸出現耳聾、癲癇、反復的卒中樣發作及認知功能減退。母親及外婆均有糖尿病。體格檢查:身材瘦小，多毛，脊柱側彎。神志清楚，中度構音障礙。雙眼皮質盲，可見粗大水平眼震，雙側軟腭上抬力弱，咽腭反射消失。四肢近端力弱，四肢肌張力低，右側Babinski征陽性。靜態血乳酸3.9mmol/L。頭MRI示右側基底節、雙側頂、枕葉及中腦多發長T1長T2信號(圖1G，H)，雙側基底節鈣化。

1.2 研究方法

1.2.1 骨骼肌病理檢查 在患者或其家屬簽署知情同意書后，對患者進行左肱二頭肌活檢。冰凍切片分別進行蘇木素-伊紅(HE)、改良Gomori三色(MGT)、油紅 O(ORO)、高碘酸 Schiff反應(PAS)、三磷酸腺苷酶(ATP酶)、還原型輔酶Ⅰ四氮唑還原酶(NADH-TR)、琥珀酸脫氫酶(SDH)、細胞色素C氧化酶(COX)及非特異性酯酶(NSE)染色。

1.2.2 mtDNA突變分析 (1)常規酚氯仿法提取肌肉組織DNA，蛋白酶K-鹽析法提取外周血DNA，玻璃奶法提取尿沉渣DNA。(2)肌肉mtDNA全長測序:具體方法見文獻［9］。(3)PCR-RFLP法檢測點突變的突變負荷:對發現的3種點突變用PCR-RFLP法進一步驗證，并進行突變負荷定量分析。PCR反應條件均為:變性94℃ 30s，退火57℃30s，延伸72℃ 30s，共32個循環。所用引物序列及限制性內切酶種類詳見表1。用Genetools圖像分析軟件掃描酶切產物的電泳條帶吸光度值，計算突變負荷。(4)PCR-RFLP法對發現的mtDNA新點突變在部分患者的母系親屬及100例正常人中進行篩查。

2 結果

2.1 臨床診斷 根據患者的臨床表現和神經影像學特點，病例1、3和4的臨床診斷為青少年起病的MELAS/LS疊加綜合征，病例2診斷為成人起病的MELAS綜合征。

2.2 肌肉病理檢查 患者1肌肉活檢未見異常。患者2和3可見SDH深染的血管(strongly succinate dehydrogenase-reactive vessels，SSVs)，未見破碎紅纖維(ragged-red fibers，RRFs)及COX陰性肌纖維。患者4肌肉病理檢查可見RRFs和SSVs。

2.3 mtDNA突變檢測 4例患者的肌肉mtDNA全長測序發現，病例 1存在 ND3編碼區的T10191C突變，導致第45位的絲氨酸變為脯氨酸(p.S45P)，該突變為已報道的致病性突變;病例2存在ND4編碼區的A11470C突變，導致第237位的賴氨酸變為天冬酰胺(p.K237N);病例3為ND5編碼區的T13046C突變，導致第237位的甲硫氨酸變為蘇氨酸(p.M237T);病例4存在長約1.4kb的mtDNA單一大片段缺失，Del 13025-13033:14417-14425，缺失范圍包括部分ND5及ND6編碼區。后3種突變均為尚未報道的新突變。為進一步證實新發現的點突變的致病性，我們用PCR-RFLP方法驗證該突變的突變負荷在肌肉、血液和尿液中存在明顯差別。此外，例3母親的血液及尿液DNA中并未檢測到T13046C突變(圖2)。對100例正常對照進行篩查，均未見A11470C和T13046C突變。例4的測序結果見圖3。

表1 PCR-RFLP法檢測例1-3的mtDNA點突變時所用引物序列及限制性內切酶

3 討論

本組4例患者的主要臨床特點為青少年發病的卒中樣發作、癲癇、偏頭痛、聽力下降、身材矮小和血乳酸水平升高，頭部MRI顯示病灶主要累及顳頂枕葉皮質，符合MELAS綜合征的表現。其中3例(例1、3、4)還有眼球活動障礙、眼球震顫、真性球麻痹、共濟失調以及肌張力障礙等腦干/基底節受累的表現，頭部MRI也顯示除皮質病灶外，雙側基底節和腦干亦有病變，提示MELAS疊加 Leigh綜合征。mtDNA全長測序證實這4例患者均攜帶mtDNA突變，突變位于ND亞單位編碼區，證實ND基因突變是部分MELAS或MELAS/Leigh疊加綜合征患者的分子病理學基礎。

我們發現這4例患者的突變分布在不同的ND亞單位編碼區，包括 ND3(T10191C突變)、ND4(A11470C突變)、ND5(T13046C突變)和影響ND5-ND6的大片段缺失。除T10191C為文獻已報道的罕見致病性突變［5，10～14］以外，其余 3 種突變均為目前尚未報道的新突變。對于A11470C和T13046C兩種新的點突變，因為它們都具有以下特點:(1)PCR-RFLP證實該突變為異質性突變;(2)在不同的組織中突變比例不同，肌肉及尿液的突變比例遠高于血液;(3)突變引起的氨基酸改變位點在種系進化過程中高度保守;(4)mtDNA全長測序除外了其它致病性突變的可能;(5)100例正常對照中沒有檢測到相同突變，綜上支持它們均為致病性突變。

在本組患者中，與其他3例患者的突變形式不同，例4為單一的mtDNA大片段缺失。mtDNA單一大片段缺失通常導致慢性進行性眼外肌麻痹、Kearn-Sayre綜合征和Pearson綜合征，而罕有導致MELAS綜合征的報道。本組例4則表現為典型的MELAS綜合征伴嚴重的腎臟受累，而沒有眼外肌麻痹的表現。到目前為止，文獻中僅有1例mtDNA大片段缺失所致的MELAS患者，該患者也同時合并Fanconi綜合征［15］。我們的發現一方面擴大了MELAS綜合征的突變譜系，另一方面也提示對MELAS綜合征合并腎臟受累的患者，當常規mtDNA點突變篩查沒有發現致病突變時，須考慮有無mtDNA片段缺失的可能性。

值得注意的是，本文中4例線粒體腦肌病患者均沒有明確的母系遺傳家族史，而且基因檢測也進一步證實例3攜帶的突變為新生突變。此點與常見的mtDNA A3243G(位于tRNA編碼區)突變有很大的不同，后者導致的MELAS患者常表現出母系遺傳的特點。而ND基因突變與A3243G突變的另外一個顯著不同之處，在于前者導致的MELAS患者常缺乏RRFs，但SSVs的出現頻率則相對較高［6］，本組患者也證實這一特點。因此，對臨床懷疑線粒體病的患者，應重視對SSVs的觀察，避免漏診。此外，部分ND基因突變患者的肌肉活檢可以完全正常，因此在肌肉活檢正常而臨床又高度懷疑線粒體病時，應優先篩查有無mtDNA編碼的ND基因的突變。

圖1 例1、例3、例4的頭部MRI表現

圖2 PCR-RFLP分析法驗證例1-3及其部分家系成員的mtDNA突變結果

圖3 mtDNA全長測序證實例4存在mtDNA單一大片段缺失(13025-13033:14417-14425)

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