回、漢族癲癇患者CYP2C9和CYP2C19基因多態性與苯巴比妥血藥濃度的相關性研究

齊明山， 顧 浩， 董 通， 許賢瑞， 王 燕， 張 慶

苯巴比妥(phenobarbital，PB)大部分通過細胞色素P450(cytochrome P450，CYP)同工酶的芳香羥化作用形成對羥基-苯巴比妥，此代謝過程CYP2C9起 主 要 作 用，CYP2C19 也 發 揮 重 要 作 用［1］。CYP2C9和CYP2C19存在明顯的遺傳多態性，且在不同種族間存在差異［2］，這表明不同種族之間CYP對PB的代謝活性也可能存在差異。寧夏地區癲癇患病率居全國首位［3］，但是尚未見寧夏地區回、漢族癲癇患者CYP2C9與CYP2C19基因多態性對PB代謝影響的相關研究。本課題旨在研究寧夏回、漢族癲癇人群CYP2C9和CYP2C19基因多態性，同時進行回、漢族癲癇人群間CYP2C9*3和CYP2C19*2基因型與等位基因頻率的比較，并探討不同基因型對PB代謝的影響，根據基因型選擇合適的劑量，指導臨床更好的用藥。

1 研究對象及材料

1.1 研究對象 從寧夏農村癲癇示范項目治療組中收集185例無合并其他疾患的癲癇患者，年齡范圍為14歲 ～79歲，平均年齡37.38±14.43歲。其中，回族患者62例(男性31例，女性31例，平均年齡33.89±12.59 歲)，漢族患者123 例(男性73例，女性50例，平均年齡35.98±13.59歲)。納入標準:(1)經臨床發作和(或)腦電圖發現癇樣放電確診的癲癇患者;(2)正規服用抗癲癇藥物(antiepileptic drugs，AEDs)治療1年以上;(3)患者本人或其監護人簽署知情同意書。排除標準:(1)肝、腎功能異常者;(2)有活動性精神障礙者;(3)妊娠及哺乳期婦女。經檢驗回、漢族兩組組內及組間性別和年齡均無顯著性差異。

入選研究個體均無血緣關系，追溯3代均為同一民族個體，且回族患者須在寧夏地區居住3代以上。

1.2 儀器與試劑 Mycycler Thermal Cycler PCR擴增儀(BIO-RAD美國)、Centriefuge常溫高速離心機(日立公司)、DYY-6D電泳儀(北京市六一儀器廠)、凝膠成像系統(BIO-RAD意大利米蘭)、水浴箱(北京長源試驗設備廠)、Agilent1100高效液相色譜儀(姜堰市新康醫療器械公司)。全血DNA提取試劑盒、Go Taq Green Master Mix、DNA Marker(Promega北京生物技術有限公司)、SamⅠ和KpnⅠ限制性內切酶(紐英倫生物技術有限公司)。

1.3 標本的采集 受試的185例患者均于清晨8時空腹采集肘靜脈血5ml 2管，EDTA-2Na抗凝，混合搖勻，于4℃冰箱保存;一份用于基因檢測;另一份離心后取血清，用于血藥濃度檢測。

1.4 血藥濃度檢測 應用Agilent1100高效液相色譜儀檢測血藥濃度:用乙醚處理血清，提上清液4.5ml于離心管中，在40℃水浴箱中揮干，加100μl流動相復溶，取20μl進樣，最后根據出峰時間及峰面積得出AEDs的血藥濃度。其中113例癲癇患者單用PB，考慮到不同患者服用PB的劑量不同，為消除誤差便于比較，根據個體服藥劑量和體重將血藥濃度標準化，用測得的血藥濃度除以每公斤體重的服藥劑量［4］，即每mg/kg藥物引起的血藥濃度變化(單位:μg·kg/ml·mg)。

1.5 DNA樣品制備 采用DNA提取試劑盒提取血液基因組DNA，應用紫外分光儀測DNA濃度，將定量后的DNA母液，取出一部分加入一定量的TE液，統一稀釋成約70ng/μl，于－20℃冰箱保存備用。

1.6 PCR擴增 參照文獻確定CYP2C19*2上游引物［5］:5’-GCAGGTATAAGTC TAGGAAATG-3’，下游引物:5’-TAAAGTCCCGAGGGTT GTTG-3’，CYP2C9*3 上 游 引 物［6］:5’-TGCACGAGGTCCAGAGGTAC-3’，下游引物:5’-CTATGAATTTGGGGACTTCG-3’，引物均由上海生工生物工程科技有限公司合成。CYP2C9*3 PCR反應體系:反應總體積25μl，包括 DNA 模板 1.5μl(70ng/μl)，CYP2C9*3 每條引物各 0.2μl(0.1μmol/μl)，Mix 12.5μl，去離子水10.6μl;反應條件為:95℃預變性5min;95℃變性 30s，60.4℃ 退火 30s，72℃ 延長 30s，循環35次，72℃再延伸7min。CYP2C19*2 PCR反應體系:反應總體積 25μl，包括 DNA 模板 1.5μl(70ng/μl)，CYP2C19*2 每條引物各 0.5μl(0.1μmol/μl)，Mix 12.5μl，去離子水 10μl;反應條件為:94℃預變性 3min;94℃變性 30s，56.1℃退火 30s，72℃延長30s，循環35次，72℃再延伸5min。

1.7 PCR產物的電泳鑒定 取PCR產物5μl上樣，電泳條件:2%瓊脂糖凝膠，電泳40min后于凝膠成像系統中拍照，看擴增產物是否符合條件。

1.8 PCR-RFLP酶切及結果驗證 經電泳分析PCR成功者進行酶切分型。CYP2C9*3酶切體系:總體積20μl，其中包含 CYP2C9*3 PCR產物10μl，限制性內切酶 KpnⅠ0.5μl(5U，NEB 公司)，10 ×NEB 緩沖液 2μl，100 × BSA 0.2μl，去離子水7.3μl，37℃水浴 14 ～16h;取酶切產物 10μl上樣電泳，電泳條件:3.5%瓊脂糖凝膠，電泳電壓90V，電流70mA，100min后于凝膠成像系統中拍照，判定基因型，選取全部雜合子基因型及隨機抽取5%的野生純合型進行基因測序，驗證結果的準確性。CYP2C19*2酶切體系:總體積 20μl，其中包含CYP2C19*2 PCR產物10μl，限制性內切酶 SamⅠ0.5μl，10 × NEB 緩沖液 2μl，去離子水 7.5μl，25℃水浴14～16h;取酶切產物10μl上樣電泳，電泳條件:3.5%瓊脂糖凝膠，電泳電壓80V，電流80mA，90min后于凝膠成像系統中拍照，判定基因型，隨機抽取10%PCR產物進行基因測序，驗證結果的準確性。

1.9 統計學處理 回、漢族癲癇患者基因頻率經Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗，各基因型已達遺傳平衡，具有群代表性。所有數據采用SPSS11.5軟件包進行統計分析。率的比較用雙側χ2檢驗，不同組之間血藥濃度的比較符合方差齊性，其顯著性檢驗使用方差分析，P＜0.05為顯著性差異。

2 結果

2.1 PCR產物 CYP2C9*3擴增片段大小為152bp，CYP2C19*2擴增片段大小為381bp，將擴增的PCR產物電泳，目的片段清晰，無特異條帶(見圖1、圖2)，說明PCR擴增較理想，符合試驗要求。

2.2 酶切分型結果 CYP2C19*2經限制性內切酶SamⅠ酶切后有3種基因型:野生純合型(G/G)有271bp和110bp兩條帶;雜合型(G/A)有381bp、271bp和110bp 3條帶;突變純合型(A/A)僅有381bp一條帶，酶切結果見圖3

2.3 基因測序結果 天根生化科技(北京)有限公司直接基因測序結果與PCR-RFLP酶切分型結果均吻合，CYP2C19*2及CYP2C9*3 PCR產物正向測序見:圖5、圖6。

2.4 CYP2C9*3和CYP2C19*2基因型與等位基因頻率 不同人群CYP2C9*3和CYP2C19*2等位基因及基因型頻率的比較采用χ2檢驗，見表1。結果顯示:回、漢族癲癇患者及漢族健康人群間CYP2C9*3和CYP2C19*2基因型及等位基因頻率比較，差異均無統計學意義(P＞0.05)。回、漢族癲癇患者CYP2C19*2等位基因頻率均明顯高于高加索人(P ＜0.05)。

2.5 CYP2C19*2及CYP2C9*3基因型與血藥濃度的關系 單用PB的113例患者的血藥濃度范圍在0.64 ～32.02μg/ml之間，服藥劑量在0.5 ～4.2mg/kg之間，標準化后PB的血藥濃度范圍在1.06 ～16.66μg·kg/ml·mg之間。各基因型回、漢族之間PB血藥濃度均具備方差齊性，比較應用兩個獨立樣本的t檢驗，結果見表2。各基因型回、漢族之間血藥濃度均無統計學差異 (P＞0.05)。

CYP2C9*3經限制性內切酶KpnⅠ酶切后僅有2種基因型:野生純合型(A/A)僅有152bp一條帶;雜合型(A/C)有 152bp、134bp和18bp 3條帶(18bp片段太短，在3.5%瓊脂糖凝膠上無法顯示，僅能顯示兩條帶)，酶切結果見圖4。

圖1 2%瓊脂糖電泳目的基因帶(152bp)A為 Marker，B及右側條帶均為PCR產物

圖2 2%瓊脂糖電泳目的基因帶(381bp)A1為 Marker，B1及右側條帶均為PCR產物

圖3 CYP2C19*2基因PCR產物酶切后電泳圖。其中A為DNA Marker，B為AA基因型;C為GA基因型;D為GG基因型

圖4 CYP2C9*3基因PCR產物酶切后電泳圖。其中A1為DNA Marker，B1為AA基因型;C1為AC基因型

圖5 CYP2C19*2各基因型基因測序圖(圖中箭頭所指為基因多態性位點)

圖6 CYP2C9*3各基因型基因測序圖(圖中箭頭所指為基因多態性位點)

表1 不同人群癲癇患者CYP2C9*3和CYP2C19*2等位基因及基因型頻率比較

表2 各基因型回、漢族癲癇患者之間PB血藥濃度比較

表3 各代謝型之間血藥濃度的比較

根據攜帶的CYP2C9和CYP2C19突變等位基因的數量及對酶活性的影響將113例單用PB的被檢者分為:CYP2C19*1/*1合并CYP2C9*1/*1野生型純合子的強代謝者(extensive metabolizer，EM)、CYP2C19*1/*2或CYP2C9*1/*3雜合狀態的中間代謝者(intermediate metabolizer，IM)、CYP2C19*1/*2合并CYP2C9*1/*3雜合突變型或CYP2C19*2/*2純合子的弱代謝者(poor metabolizer，PM)［8］。EM、IM、PM 3 種代謝型例數及所占比例分別為:46 例(40.7%)、49 例(43.4%)、18 例(15.9%)。不同代謝型PB血藥濃度符合方差齊性，比較應用單因素方差分析，結果見表3。PM組高于EM組(P＜0.01)，IM 組高于 EM 組(P ＜0.05)。PM 組均數高于IM組，但無統計學差異(P＞0.05)

3 討論

CYP是一類亞鐵血紅蛋白-硫醇鹽蛋白的超家族，主要存在于肝細胞微粒體與線粒體內膜上，是一種末端加氧酶，參與生物體內多種藥物代謝，因其還原態與CO結合后，在450nm處具有高光吸收峰而得名。CYP2C9、CYP2C19屬于CYP超家族，是現在研究最多的兩種同工酶，是影響多種AEDs在體內代謝的主要因素［8］。目前研究認為 CYP2C9基因、CYP2C19基因多態性決定這兩種同工酶的活性，是引起多種AEDs療效和副作用差異的重要因素。CYP2C9基因、CYP2C19基因均存在明顯的多態性，中國人常見的等位基因多態性位點是CYP2 C9*3和 CYP2C19*2，分別為 CYP2C9第 7號外顯子A1075C、CYP2C19第5號外顯子 G681A點變異所致，Blanca等研究發現不同種族間兩種等位基因頻率存在一定的差異性［9］。這些點變異導致CYP2C9與CYP2C19酶活性下降，使AEDs血藥濃度增高，引起與血藥濃度相關的不良反應。

我們應用PCR-RFLP技術測定回、漢族癲癇患者CYP2C9*3等位基因頻率分別為:5.6%、4.5%，回、漢族癲癇患者CYP2C19*2等位基因頻率分別為:27.4%、29.7%，兩個等位基因頻率與文獻報道的中國人群 CYP2C9*3［10］、CYP2C19*2［11］等位基因變異頻率相似。CYP2C9基因與CYP2C19基因是人類的正常基因，并非致病基因，中國回、漢兩族癲癇人群中兩種基因型及等位基因分布情況無明顯差異。但通過比較回、漢族癲癇人群CYP2C19*2等位基因頻率高于高加索人，說明兩種等位基因突變存在種族差異，所以還不能排除擴大樣本量后回、漢兩民族兩種基因型及等位基因存在差異的可能性。Negar等人［12］報道高加索人CYP2C19*2等位基因頻率為10% ～16%，在北伊拉克人為14%，而在亞洲人 為 31% ～ 37%;Kirchheiner等 人［13］研 究CYP2C9有一個位點或兩個位點突變者，在高加索人中占35%，在美國黑人占13%，而在亞洲人群中僅占3.5%，進一步證實了兩種等位基因突變的種族差異性。荷蘭高加索人比瑞士高加索人群的CYP2C9突變頻率更低［8］，除外實驗的偶然性，這表明即使不同地區的同一種族人群基因突變頻率也存在差異性。因此，我們認為種族、地域差異性可能會對CYP2C9、CYP2C19基因多態性有一定的影響，不過這有待于進一步的研究證實。

PB是一種經典的、應用廣泛的AEDs，是發展中國家治療癲癇的主要用藥之一，但PB存在一些副作用，特別是其神經毒性效應，如鎮靜、行為異常、認知功能損害及抑郁情緒等，在臨床應用過程中值得特別注意［14］。Sand Grover等［8］研究表明 CYP2C9*3與CYP2C19*2基因型會使PB等AEDs的血藥濃度升高，不同種族之間代謝型頻率的差異性對藥物的療效和不良反應有明顯的影響。我們研究發現CYP2C9*3和CYP2C19*2與PB的代謝活性降低關系密切，服用同等劑量的PB，CYP2C9*1/*3型血藥濃度較 CYP2C9*1/*1型高 44.4%，而CYP2C19*2各基因型之間血藥濃度沒有明顯差別。Shuji Goto等人［15］的研究與我們的結論相似。Yukawa等［16］研究發現PB主要通過CYP2C9和CYP2C19的芳香羥化作用形成p-羥化-苯巴比妥，在健康志愿者中應用CYP2C19阻滯劑，可使苯巴比妥的最大血藥濃度增加24%，但也有人報道CYP2C19介導的氧化作用在PB的代謝過程中發揮的作用相對較小［8］。我們還進行了不同代謝型之間血藥濃度的比較，PM和IM患者的血藥濃度明顯高于野生型EM，發現PB血藥濃度在變異基因攜帶者中明顯增高，且血藥濃度增高的程度與變異等位基因的數量呈正相關。

PB的代謝受CYP2C9和CYP2C19基因調控，CYP2C9*3和CYP2C19*2等位基因發生變異的患者應該減少藥物劑量，盡可能的減少和避免藥物不良反應，以達到臨床個體化治療的目的。

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