骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療對(duì)大鼠腦梗死后神經(jīng)再生抑制因素的影響

梁松嵐， 郝 光， 楊風(fēng)剛， 金永華， 馮念蘋(píng)

神經(jīng)再生是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)，其中Nogo-A、少突膠質(zhì)細(xì)胞髓磷酯糖蛋白(oligodendrocyte myelin glycoprotein，OMgp)和髓磷酯相關(guān)糖蛋白 (myelinassociated glycoprotein，MAG)是3種重要的神經(jīng)軸突生長(zhǎng)抑制因子。既往研究證實(shí)3種分子對(duì)軸突再生有較強(qiáng)的抑制作用［1］。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs)已被證明移植后可進(jìn)入到受損腦組織區(qū)域，分泌神經(jīng)生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子等，減少缺血半暗帶的細(xì)胞凋亡，改善局部血液循環(huán)，促進(jìn)軸突再生和突觸重建，從而有利于損傷后的神經(jīng)功能恢復(fù)［2］，但其促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)的機(jī)制是否與下調(diào)神經(jīng)再生抑制因子的表達(dá)有關(guān)尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立大鼠腦缺血再灌注模型來(lái)進(jìn)一步探討B(tài)MSCs移植后促進(jìn)大鼠腦梗死神經(jīng)功能恢復(fù)的機(jī)制，為干細(xì)胞移植治療腦梗死完善理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑 DMEM培養(yǎng)液 (美國(guó) Hyclone公司);胎牛血清(美國(guó) Hyclone公司);胰酶(北京索來(lái)寶科技有限公司);Nogo-A兔抗多克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司);OMgp兔抗多克隆抗體，MAG兔抗多克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司);二步法免疫組化檢測(cè)試劑，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 健康SD大鼠，體質(zhì)量80～120g，雌雄不限，哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物模型:健康SD大鼠102只，體質(zhì)量220～280g，雄性，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為假手術(shù)組(Sham組)、損傷對(duì)照組(MCAO組)、溶劑對(duì)照組(Vehicle組)和移植組(BMSCs組)，各組再自造模成功起計(jì)算分為3、7、14、21 d組，每組6 只，其中3d 組共12 只，6 只取材，6只用于觀察BMSCs分布。

1.3 局灶性腦缺血再灌注模型建立 采用改良Longa法［3］制備大鼠左側(cè)大腦中動(dòng)脈缺血再灌注模型。線栓采用直徑0.234mm的魚(yú)線頭端蘸蠟。用10%水合氯醛 (0.35ml/100g)腹腔麻醉大鼠，仰臥固定，在頸部正中略偏左行2.0～2.5cm 縱向切口，暴露分離出左側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈。線栓經(jīng)頸總動(dòng)脈插入頸內(nèi)動(dòng)脈，自分叉處計(jì)算插線長(zhǎng)度約18～20mm。假手術(shù)組除不插入線栓外，其余過(guò)程同上。腦缺血2h后，輕輕抽出尼龍線至有阻力感，實(shí)施再灌注。按 Zea Longa評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［3］對(duì)術(shù)后動(dòng)物評(píng)分，0分:無(wú)神經(jīng)缺損癥狀;1分:不能伸展右側(cè)前爪;2分:行走時(shí)向右側(cè)轉(zhuǎn)圈;3分:行走時(shí)向右側(cè)傾倒;4分:不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失，1～3分者納入實(shí)驗(yàn)。

1.4 神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分 評(píng)分觀察者為非本試驗(yàn)組人員，在損傷后不同時(shí)間點(diǎn)參照Chen等［4］發(fā)表的改良神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分(modified neurological severity score，mNSS)方法，去掉了一些不易判斷結(jié)果的項(xiàng)目，如深感覺(jué)檢測(cè)、平衡試驗(yàn)等。所有動(dòng)物在術(shù)后3、7、14、21d分別進(jìn)行評(píng)分。

1.5 BMSCs的分離與培養(yǎng) 脫頸處死大鼠，無(wú)菌操作取出雙側(cè)股骨、脛骨，剔肉，暴露骨髓腔。用注射器抽取DMEM培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)沖洗骨髓腔，收集骨髓細(xì)胞液，輕輕吹打均勻，然后用200目無(wú)菌金屬濾網(wǎng)過(guò)濾。以1×109個(gè)/L的密度接種于培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。接種后48h更換培養(yǎng)液，去除未貼壁細(xì)胞，此后每2d更換培養(yǎng)液1次。培養(yǎng)10～14d，以1∶2比例傳代培養(yǎng)。其后每2d更換培養(yǎng)液1次，每7～10d傳代1次。

1.6 BMSCs的標(biāo)記與移植 收集第3代MSCs，綠色熒光染料羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂(CFSE)標(biāo)記，具體步驟按說(shuō)明書(shū)操作。將標(biāo)記的BMSCs用0.01mol/L PBS稀釋成3×109個(gè)/L的細(xì)胞懸液。于缺血24h，移植組經(jīng)大鼠尾靜脈注入1ml BMSCs懸液，對(duì)照組注入0.01 mol/L PBS 1ml。

1.7 BMSCs在腦內(nèi)分布的觀察 移植3d組處死6只大鼠，迅速取出腦組織，立即放入液氮中，以視交叉為中心定位制成冰凍切片，丙酮固定5min，倒置熒光顯微鏡下，用波長(zhǎng)488nm的激發(fā)光觀察由CFSE標(biāo)記的BMSCs在移植大鼠腦內(nèi)的存活及分布情況。

1.8 免疫組織化學(xué)染色 各組按相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，過(guò)量麻醉，左心室插管，先后灌注0.9%生理鹽水、4%多聚甲醛溶液各100ml內(nèi)固定，斷頭取腦，置于超過(guò)標(biāo)本體積10倍的4%多聚甲醛溶液中外固定至24h。以視交叉為中心向前、后各取2mm厚的冠狀腦片，充分固定后常規(guī)脫水，透明、石蠟包埋、連續(xù)切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，檢測(cè)Nogo-A、OMgp和MAG蛋白的表達(dá)。Nogo-A抗體滴度為1∶30，OMgp抗體滴度1∶80，MAG抗體滴度1∶100。光學(xué)顯微鏡下觀察，胞漿中有棕黃色顆粒的為陽(yáng)性細(xì)胞。每張切片于梗死灶周圍選擇10個(gè)表達(dá)最強(qiáng)的視野，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)后取平均值。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs的分離與培養(yǎng) 原代培養(yǎng)的骨髓細(xì)胞接種3d，部分貼壁生長(zhǎng)，多呈長(zhǎng)梭形、三角形和多角形，即為BMSCs。5d開(kāi)始，部分BMSCs形成集落。于7～12d開(kāi)始呈指數(shù)增長(zhǎng)，具有一定的方向性，呈束狀或放射狀排列。14d左右，細(xì)胞貼壁率達(dá)90%。傳代培養(yǎng)的BMSCs形態(tài)多為長(zhǎng)梭形，較原代細(xì)胞體積增大，增殖速度加快，貼壁能力增強(qiáng)，7d左右貼壁率達(dá)80% ～90%(見(jiàn)圖1、圖2)。

2.2 BMSCs在腦組織中的分布 熒光顯微鏡下可觀察到發(fā)綠色熒光的BMSCs，表明BMSCs在移植后到達(dá)腦組織，在腦組織中存活良好(見(jiàn)圖3)。

2.3 大鼠神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分 BMSCs組在7、14和21d神經(jīng)功能缺損評(píng)分優(yōu)于MCAO組和Vehicle組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05(見(jiàn)表1)。

2.4 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 Nogo-A陽(yáng)性染色主要在少突膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，神經(jīng)元中也有表達(dá)，大體成環(huán)狀或半弧形分布。Sham組各時(shí)間點(diǎn)損傷區(qū)周邊白質(zhì)中可見(jiàn)少量散在的Nogo-A陽(yáng)性細(xì)胞，MCAO組和Vehicle組Nogo-A陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)于造模成功后3d增加，7d有所減少，14d達(dá)到高峰，21d時(shí)減少，在3、14和21d時(shí)Nogo-A陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)均高于Sham組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，差異具有顯著性(P＜0.05)。BMSCs組 Nogo-A陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在 3、14和21d均少于 MCAO組和 Vehicle組(P＜0.05)，其中，BMSCs組14d Nogo-A陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)仍高于Sham組14d時(shí)的表達(dá)(P＜0.05)。

OMgp陽(yáng)性染色在少突膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元中均有表達(dá)，成環(huán)狀或弧形分布于細(xì)胞質(zhì)。Sham組各時(shí)間點(diǎn)損傷區(qū)周邊白質(zhì)中可見(jiàn)少量散在的OMgp陽(yáng)性細(xì)胞，MCAO組和Vehicle組OMgp陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)于造模成功后3d增加，14d達(dá)到高峰，21d時(shí)仍然維持在14d水平，在3、7、14和21d時(shí)OMgp陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)均高于 Sham組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)(P＜0.05)。BMSCs組OMgp陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在7、14和21d均少于MCAO組和Vehicle組(P＜0.05)。MAG陽(yáng)性染色在少突膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，成環(huán)狀或弧形分布。Sham組各時(shí)間點(diǎn)損傷區(qū)周邊白質(zhì)中可見(jiàn)少量散在的MAG陽(yáng)性細(xì)胞，MCAO組和Vehicle組MAG陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)于造模成功后3d明顯增加，7d至14d保持同3d水平，至21d時(shí)減少，在3、7、14和21d時(shí)MAG陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)均高Sham組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)(P＜0.05)。BMSCs組 MAG 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在 3、7、14 和21d均少于MCAO組和Vehicle組(P＜0.05)(見(jiàn)表2～表4、圖4～圖6)。

圖1 光學(xué)顯微鏡下原代培養(yǎng)14d(×100)

圖2 第3代BMSCs(×100)

圖3 熒光顯微鏡下移植BMSCs分布(×200)

圖4 光學(xué)顯微鏡下Nogo-A的表達(dá)(×400)

圖5 光學(xué)顯微鏡下OMgp的表達(dá)(×400)

圖6 光學(xué)顯微鏡下MAG的表達(dá)(×400)

表1 各組不同時(shí)間點(diǎn)mNSS評(píng)分結(jié)果 ± s，n=6)

表1 各組不同時(shí)間點(diǎn)mNSS評(píng)分結(jié)果 ± s，n=6)

與MCAO 組比較#P ＜0.05，與 Vehicle組比較*P ＜0.05

組別3d 7d 14d 21d MCAO組Vehicle組BMSCs組3.67 ±0.523.50 ±0.553.33 ±0.522.83 ±0.752.83 ±0.751.83 ±0.41#*2.17 ±0.752.33 ±0.521.17 ±0.41#*2.00 ±0.632.00 ±0.631.17 ±0.41#*

表2 各組不同時(shí)間點(diǎn)Nogo-A陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較 ± s，n=6)

表2 各組不同時(shí)間點(diǎn)Nogo-A陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較 ± s，n=6)

與Sham 組比較#P ＜0.05，和 MCAO 組比較*P＜0.05，和Vehicle組比較 ＆ P ＜0.05

Sham組MCAO組Vehicle組BMSCs組20.87 ±4.1131.02 ±3.85#31.90 ±3.03#24.97 ±4.20*＆22.82 ±5.7925.07 ±3.0026.10 ±3.7421.93 ±2.6825 ±5.79528 ±4.55#54.87 ±6.04#40.77 ±6.68#*＆23.77 ±7.5839.60 ±5.84#39.00 ±4.90#30.38 ±3.86*＆

± s，n=6)表3 各組不同時(shí)間點(diǎn)OMgp陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較

± s，n=6)表3 各組不同時(shí)間點(diǎn)OMgp陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較

與Sham 組比較#P ＜0.05，和 MCAO 組比較*P＜0.05，和Vehicle組比較 ＆ P ＜0.05

Sham組MCAO組Vehicle組BMSCs組21.58 ±3.4432.60 ±5.14#33.17 ±5.02#30.42 ±3.58#21.05 ±2.6840.87 ±3.12#42.52 ±4.86#31.22 ±3.22#*＆22.17 ±3.8646.02 ±3.35#45.37 ±4.26#32.55 ±5.94#*＆23.25 ±4.7547.25 ±3.64#48.47 ±3.26#32.23 ±3.97#*＆

表4 各組不同時(shí)間點(diǎn)MAG陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較 ± s，n=6)

表4 各組不同時(shí)間點(diǎn)MAG陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較 ± s，n=6)

與Sham 組比較#P ＜0.05，和 MCAO 組比較*P＜0.05，和Vehicle組比較 ＆ P ＜0.05

Sham組MCAO組Vehicle組BMSCs組41.47 ±4.5868.48 ±6.35#70.47 ±4.21#51.68 ±7.21#*＆41.12 ±3.4366.70 ±5.01#68.77 ±5.44#55.28 ±9.91#*＆42.85 ±4.4367.32 ±6.69#69.38 ±4.95#53.52 ±7.70#*＆39.97 ±4.2355.53 ±7.80#56.25 ±7.03#44.02 ±8.16*＆

3 討論

腦梗死后梗死灶中心區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞完全缺血壞死，周圍的神經(jīng)細(xì)胞也受到了不同程度的損傷。雖然中樞神經(jīng)系統(tǒng)有一定的再生潛能，但是損傷后軸突再生抑制因子的存在不利于軸突生長(zhǎng)，阻礙神經(jīng)功能恢復(fù)。Nogo-A、OMgp和MAG是3種重要的髓鞘源性軸突再生抑制因子，是神經(jīng)再生抑制微環(huán)境重要的組成成員。Nogo-A是Nogo基因編碼3種產(chǎn)物之一，含有1163個(gè)氨基酸殘基，主要表達(dá)于少突膠質(zhì)細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞表面。目前研究發(fā)現(xiàn)Nogo-A 有3 個(gè)活性區(qū)域［5］，可與受體 NgR 和 PirB［6］及結(jié)合素結(jié)合而發(fā)揮誘導(dǎo)生長(zhǎng)錐塌陷和阻斷軸突生長(zhǎng)的作用。Papadopoulos等［7］發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用 Nogo-A單克隆抗體IN-1可促進(jìn)大鼠腦梗死后皮質(zhì)錐體細(xì)胞樹(shù)突生成增加，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。OMgp在神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)，是一種糖基磷脂酰肌醇連接蛋白(glycosylphosphatidyl-inositol-linked protein)，錨定于少突細(xì)胞和神經(jīng)元的胞膜上;MAG屬于免疫球蛋白樣凝集素家族成員，與神經(jīng)細(xì)胞黏附分子(neural cell adhesion molecule，NCAM)高度同源，是一種含有600個(gè)氨基酸的跨膜蛋白，根據(jù)mRNA剪接形式的不同，生成的MAG產(chǎn)物分為兩種異構(gòu)體，即L-MAG和S-MAG。William等最近發(fā)現(xiàn)，在脊髓損傷的小鼠模型中，OMgp和MAG能夠與Nogo-A發(fā)揮協(xié)同效應(yīng)一起限制軸突生長(zhǎng)和神經(jīng)功能恢復(fù)［8］。

干細(xì)胞移植治療技術(shù)仍然是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。BMSCs已被證明移植后可以通過(guò)多種機(jī)制促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。BMSCs到達(dá)損傷部位以后可向神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，重建神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)［9］，可分泌各種神經(jīng)生長(zhǎng)因子如堿性成纖維生長(zhǎng)因子(Fibroblast growt h factor，F(xiàn)GF)［10］、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(Nerve growt h factor，NGF)［11］等參與損傷修復(fù)過(guò)程，同時(shí)還可以通過(guò)增加新生血管［12］來(lái)改善局部血液供應(yīng)，加快神經(jīng)功能恢復(fù)。有學(xué)者對(duì)接受BMSCs移植的腦梗死大鼠進(jìn)行為期一年的研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs移植可減小膠質(zhì)瘢痕的厚度，減少瘢痕附近Nogo-A表達(dá)的細(xì)胞數(shù)量，促進(jìn)大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)［13］。但是BMSCs移植后對(duì)神經(jīng)再生抑制微環(huán)境其它因子有何影響，目前未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

本研究采用全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)BMSCs，經(jīng)尾靜脈進(jìn)行BMSCs移植。腦梗死后3d在損傷周邊區(qū)腦組織中觀察到CFSE染色的綠色陽(yáng)性細(xì)胞，表明移植的BMSCs能向受損部位遷移、募集、存活。在大鼠腦組織缺血損傷后，Nogo-A、OMgp和MAG表達(dá)較假手術(shù)組均有不同程度增加，且兩個(gè)對(duì)照組之間相比無(wú)明顯差異，而B(niǎo)MSCs組結(jié)果顯示，多數(shù)時(shí)間點(diǎn)3種蛋白陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)都有所下降，且BMSCs組神經(jīng)功能缺損評(píng)分結(jié)果表明該組大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)優(yōu)于兩個(gè)對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

因此，我們認(rèn)為腦梗死后Nogo-A、OMgp和MAG 3種神經(jīng)再生抑制因子的表達(dá)增加抑制神經(jīng)再生，阻礙了神經(jīng)功能恢復(fù)，而B(niǎo)MSCs移植可通過(guò)在一定程度上下調(diào)Nogo-A、OMgp和MAG的表達(dá)，削弱三者對(duì)神經(jīng)再生的抑制作用，進(jìn)而促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。

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