轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β受體Ⅰ在紅藻氨酸致癲癇大鼠額葉和海馬的表達(dá)

俸軍林， 王 晶， 蔣靜子， 康俊玲

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β(transforming growth factor-β，TGFβ)是在20世紀(jì)八十年代早期發(fā)現(xiàn)的具有轉(zhuǎn)化特性的蛋白質(zhì)，參與體內(nèi)多種病理和生理過(guò)程，它在細(xì)胞膜表面的受體有3個(gè)亞型，即Ⅰ型、Ⅱ型及Ⅲ型受體(TβRⅠ、TβRⅡ、TβRⅢ)［1］。TGFβ 及其受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)廣泛表達(dá)，通常認(rèn)為T(mén)βRⅠ是中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫和炎癥過(guò)程的重要調(diào)節(jié)因子，是一種有效的免疫調(diào)節(jié)劑［2］。目前，有學(xué)者提出TβRⅠ參與了癲癇的發(fā)病機(jī)制，但尚需進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)利用立體定向技術(shù)行側(cè)腦室注射紅藻氨酸建立大鼠顳葉癲癇模型，用Western Bloting技術(shù)檢測(cè)癲癇發(fā)作后不同時(shí)間點(diǎn)大鼠額葉及海馬組織中TβRⅠ蛋白的表達(dá)情況，以探討TβRⅠ與癲癇的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及動(dòng)物模型制作

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 雄性250～300g遠(yuǎn)交群(SD)大鼠60只，購(gòu)自桂林醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)條件:溫暖(20℃)、避強(qiáng)光、避噪音、單籠、自由進(jìn)食和飲水。60只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分成對(duì)照組(10只)和模型組(50只)，模型組按照致癇后動(dòng)物處死時(shí)間再分為6h、12h、24h、72h、1w共5個(gè)亞組，每組10只。

1.1.2 動(dòng)物模型制作 以3.6%水合氯醛360mg/kg腹腔注射麻醉SD大鼠，將大鼠頭部固定在腦立體定向儀上，備皮，碘伏局部消毒后再用酒精消毒一次。鋪孔巾，沿頭部正中線切開(kāi)頭皮約1cm，暴露前囟。按照大鼠腦立體定向圖譜確定側(cè)腦室位置(前囟后0.8mm，右側(cè)旁開(kāi)1.5mm)，鉆一直徑為1.0mm的圓孔，深度達(dá)硬腦膜表面，將預(yù)先裝有KA的微量進(jìn)樣器沿鉆孔進(jìn)針，深度達(dá)4.5mm時(shí)緩慢進(jìn)針，在10min 內(nèi)緩慢勻速注射 1μg/μl KA 溶液 lμl，完畢后留針5min，緩慢拔除穿刺針，用骨蠟封閉顱骨鉆孔，縫合頭皮，放回籠中作行為學(xué)觀察。按Racine［3］分級(jí)判斷癲癇發(fā)作程度，Ⅲ級(jí)以上為成功動(dòng)物模型。

1.1.3 腦組織的獲取 按上述分組時(shí)間點(diǎn)，麻醉后斷頭處死大鼠，在冰臺(tái)上取出大鼠腦組織，先取黃豆大小的額葉組織置入凍存管中，再于大腦背側(cè)先用手術(shù)刀片輕劃一刀，用鑷子背緣迅速分離大腦組織，暴露出兩側(cè)海馬，然后取出兩側(cè)海馬，同樣置入凍存管中，放入液氮中凍存。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 主要儀器試劑、儀器 Narishige SR-6R大鼠腦立體定向儀(日本產(chǎn))，DYCP-31A型電泳儀(北京六一儀器廠)，DF-6P3C型超聲細(xì)胞破碎機(jī)(寧波新芝科器研究所)，TE-22型轉(zhuǎn)膜儀(美國(guó)通用電器公司)，JS-380型凝膠分析系統(tǒng)儀器(南寧精密儀器儀表有限公司);主要試劑:紅藻氨酸(Sigma-Aldrich)，Marker(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、Western細(xì)胞裂解液和GAPDH抗體為碧云天生物技術(shù)公司提供，TβRⅠ(Santa Cruz Biotechnology)。

1.2.2 Western Bloting 檢測(cè)腦組織中 TβRⅠ蛋白的表達(dá)

(1)總蛋白的提取:取液氮中保存的腦組織100mg置入研磨器中，研磨成粉末后轉(zhuǎn)入EP管中，加入1ml蛋白裂解液(含PMSF)裂解30min后，置于超聲細(xì)胞粉碎機(jī)下徹底粉碎組織;4℃下12000r/min離心30min，取上清蛋白分裝于EP凍存管中，并置于－80℃保存。按BCA試劑盒說(shuō)明制作標(biāo)準(zhǔn)曲線并測(cè)定蛋白含量。

(2)凝膠電泳:取總蛋白50μg，加等量2×加樣緩沖液，100℃煮沸5min，冷卻后10000r/min離心30s。在直流電壓100～120V下進(jìn)行電泳，當(dāng)?shù)鞍讞l帶遷移至底部時(shí)即關(guān)閉電源。

(3)轉(zhuǎn)膜:根據(jù)Marker條帶將膠條割至合適大小，用轉(zhuǎn)膜緩沖液平衡，將濾紙、PVDF膜切成與凝膠尺寸大小，轉(zhuǎn)膜裝置從下至上依次按陽(yáng)極碳板、2層濾紙、PVDF膜、凝膠、2層濾紙、陰極碳板的順序放好，接通電源，恒流1mA/cm2，轉(zhuǎn)移2h。

(4)免疫反應(yīng):將膜用TBS從下向上浸濕后，移至含有封閉液的平皿中，室溫下脫色搖床上搖動(dòng)封閉1h，加 TβRⅠ多克隆抗體(1∶500)，4℃雜交過(guò)夜，用TBST液洗膜30min(洗滌次數(shù)約2～3次)后用HRP標(biāo)記的二抗雜交，37℃，1h。雜交后用TBST液洗膜30min(洗滌次數(shù)約2～3次)。

(5)化學(xué)發(fā)光、顯影、定影:將雜交膜置于發(fā)光顯影液中，保鮮膜包好，放入X光片夾中。在紅燈下取出X光片，迅速浸入顯影液中顯影，待出現(xiàn)明顯條帶后，立即把X光片浸入定影液中，以膠片透明為止。用自來(lái)水沖去膠片上殘留的定影液，室溫下晾干。

(6)凝膠圖象分析:將膠片進(jìn)行掃描或拍照，用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析，計(jì)算待測(cè)基因與GA PDH光密度比值，然后與對(duì)照組進(jìn)行比較。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)大鼠的行為學(xué)觀察

側(cè)腦室注入KA后10～30min，模型組絕大部分大鼠即表現(xiàn)出胡須顫動(dòng)、面部驚厥、節(jié)律性點(diǎn)頭、單側(cè)前肢的陣攣，持續(xù)約30 min;注射后1～3h出現(xiàn)反復(fù)發(fā)作的凝視、咀嚼、流涎、面部抽搐、肢體抽搐、身體背曲、尾部翹起、站立跌倒等癲癇發(fā)作表現(xiàn)。每次發(fā)作數(shù)秒至十余秒，反復(fù)間歇發(fā)作數(shù)小時(shí);6～8h后發(fā)作次數(shù)逐漸減少，24h～1w期間可出現(xiàn)間斷性自發(fā)性發(fā)作。按Racine［3］分級(jí)標(biāo)準(zhǔn):0級(jí):0只，Ⅰ級(jí):0只，Ⅱ級(jí):0只，Ⅲ級(jí)19只，Ⅳ級(jí):21只，Ⅴ級(jí)10只，符合模型組標(biāo)準(zhǔn)，全部認(rèn)為造模成功，術(shù)后無(wú)法耐受全身強(qiáng)直發(fā)作死亡5只，其中Ⅴ級(jí)3只，Ⅳ級(jí)2只，為達(dá)到平均分組再次造模5只，均達(dá)到入選標(biāo)準(zhǔn)，無(wú)死亡。生理鹽水組(對(duì)照組)大鼠無(wú)上述異常表現(xiàn)。

2.2 大鼠額葉及海馬組織TβRⅠ蛋白的表達(dá)

2.2.1 額葉 與對(duì)照組比較，模型組大鼠額葉組織中TβRⅠ蛋白的表達(dá)在致癇后6h開(kāi)始增高，72h左右達(dá)高峰，約1w后表達(dá)有所減弱。模型組大鼠致癇后各亞組額葉組織中TβRⅠ蛋白表達(dá)均顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)(見(jiàn)表1、圖1)。

2.2.2 海馬 與對(duì)照組比較，模型組大鼠額葉組織中TβRⅠ蛋白的表達(dá)在致癇后6h開(kāi)始增高，72h左右達(dá)高峰，約1w后表達(dá)有所減弱。模型組大鼠致癇后各亞組海馬組織中TβRⅠ蛋白表達(dá)均顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)(見(jiàn)表1、圖2)。

2.2.3 額葉與海馬TβRⅠ蛋白表達(dá)的比較統(tǒng)計(jì)分析顯示，海馬組織中TβRⅠ蛋白的表達(dá)比額葉更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(見(jiàn)表1)。

表1 模型組與對(duì)照組大鼠TβRⅠ蛋白/GAPDH灰度值比值±s)

表1 模型組與對(duì)照組大鼠TβRⅠ蛋白/GAPDH灰度值比值±s)

與對(duì)照組比較*P＜0.01;與海馬比較#P＜0.05

組別 n 額葉 海馬對(duì)照組6h組12h組24h組72h組1w組1010101010100.165 ±0.1860.351 ±0.095*#0.395 ±0.115*#0.433 ±0.159*#0.463 ±0.141*#0.410 ±0.178*#0.173 ±0.1990.323 ±0.115*0.511 ±0.159*0.563 ±0.164*0.651 ±0.171*0.508 ±0.111*

圖1 Western Bloting檢測(cè)各組大鼠額葉TβRⅠ蛋白的表達(dá)

圖2 Western Bloting檢測(cè)各組大鼠海馬TβRⅠ蛋白的表達(dá)

3 討論

KA側(cè)腦室注射所致大鼠癲癇模型主要是模擬人類顳葉癲癇。實(shí)驗(yàn)表明，癲癇腦組織中星型膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生了明顯的數(shù)量、形態(tài)及功能的變化，星型膠質(zhì)細(xì)胞增生可作為顳葉癲癇患者的病理學(xué)特征［4］。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子家族(TGFs)是多效性的細(xì)胞因子，在細(xì)胞間通信起著關(guān)鍵作用，其信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、增殖、黏附、遷移及凋亡等生理病理過(guò)程起重要作用［5］。TGFs發(fā)揮發(fā)生物作用主要通過(guò)TβRⅠ和TβRⅡ激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)系統(tǒng)，如:Smads蛋白通路或P38 MAPK通路，將TβRⅠ的信號(hào)由胞漿傳遞到胞核調(diào)節(jié)相應(yīng)的靶基因轉(zhuǎn)錄［6］。Cacheaux等［7］提出TGF可作為“一個(gè)新的抑制膠質(zhì)細(xì)胞功能，在癲癇發(fā)生過(guò)程中改變膠質(zhì)細(xì)胞-神經(jīng)元信息連通的途徑”。既往已有報(bào)道表明，TβRⅠ介導(dǎo)腎臟和肺的內(nèi)皮細(xì)胞攝取蛋白質(zhì)［8］。TβRⅠ廣泛表達(dá)于大腦神經(jīng)系統(tǒng)，腦損傷后TβRⅠ表達(dá)明顯增高，但TβRⅠ與癲癇的關(guān)系尚未明了。有學(xué)者提出，TβRⅠ介導(dǎo)星型膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)血清蛋白質(zhì)參與癲癇的發(fā)生［9］。其研究是通過(guò)脫氧皮質(zhì)固酮破壞血腦屏障建立起體內(nèi)模型，采用熒光標(biāo)記跟蹤技術(shù)可見(jiàn)BBB通透性增高，血清蛋白質(zhì)通過(guò)胞內(nèi)隆突從核外轉(zhuǎn)移到核內(nèi)。將皮質(zhì)區(qū)域暴露于 TβRⅠ激酶活性抑制劑SB431542中，減少了熒光素-白蛋白標(biāo)記細(xì)胞的數(shù)量，并且標(biāo)記的部分顯示主要為細(xì)胞膜染色，沒(méi)有細(xì)胞核染色，表明血清蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)是依賴于TβRⅠ。將大鼠皮質(zhì)暴露于缺乏TβRⅠ的血清蛋白質(zhì)環(huán)境中，與暴露于含有TβRⅠ的血清蛋白質(zhì)環(huán)境中進(jìn)行對(duì)照，發(fā)現(xiàn)腦微環(huán)境暴露于后者能產(chǎn)生的癇樣活動(dòng)，人為使用TβRⅠ抑制劑可抑制蛋白質(zhì)的攝取，說(shuō)明蛋白質(zhì)進(jìn)入星型膠質(zhì)細(xì)胞是由 TβRⅠ介導(dǎo)的。Koller H等［10］發(fā)現(xiàn)，在大鼠癲癇模型中反應(yīng)性星型膠質(zhì)細(xì)胞中TβRⅠ激活引起K+內(nèi)向整流通道下調(diào)，最終細(xì)胞外功能依賴性K+聚集，NMDA受體激活而促發(fā)癇樣活動(dòng)。以上資料表明，星型膠質(zhì)細(xì)胞攝取蛋白質(zhì)是由TβRⅠ介導(dǎo)的，TβRⅠ激活使星型膠質(zhì)細(xì)胞K+通道快速下調(diào)，更進(jìn)一步證明TβRⅠ與蛋白質(zhì)的相互作用直接調(diào)節(jié)星型膠質(zhì)細(xì)胞的功能，并參與癲癇的發(fā)病機(jī)制。重慶市癲癇病防治中心利用患者腦庫(kù)組織進(jìn)行臨床實(shí)驗(yàn)，參考基因芯片表達(dá)譜的結(jié)果，研究TβRⅠ在顳葉癲癇灶中的表達(dá)情況，實(shí)驗(yàn)研究表明難治性顳葉灶中星型膠質(zhì)細(xì)胞TβRⅠ蛋白表達(dá)明顯增高，提出TβRⅠ可能參與人類顳葉癲癇的發(fā)病［11］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠額葉組織及海馬組織中TβRⅠ的表達(dá)呈現(xiàn)出動(dòng)態(tài)改變，在致癇后早期顯著增高，以海馬為甚，進(jìn)一步證明TβRⅠ參與了癲癇早期的發(fā)病機(jī)制。

額葉是大腦發(fā)育中最高級(jí)的部分，它包括初級(jí)運(yùn)動(dòng)區(qū)、前運(yùn)動(dòng)區(qū)和前額葉，額葉的主要功能與精神、語(yǔ)言和隨意運(yùn)動(dòng)有關(guān)。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)，25%癲癇患者較正常人群存在認(rèn)知功能障礙［12］。海馬擔(dān)當(dāng)著關(guān)于記憶以及空間定位的作用，KA致癇大鼠行為學(xué)表現(xiàn)與人類顳葉癲癇十分相似，致癇后大鼠海馬CA3區(qū)和齒狀回均出現(xiàn)明顯的神經(jīng)元脫失并有膠質(zhì)細(xì)胞增生，神經(jīng)元變性及大量固縮的壞死神經(jīng)元［13］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大鼠致癇后TβRⅠ蛋白在海馬組織表達(dá)較額葉更加顯著，提示顳葉癲癇腦組織損傷以海馬結(jié)構(gòu)為主，同時(shí)有額葉腦組織損傷。

目前，TβRⅠ參與癲癇發(fā)病機(jī)制的研究甚少，本實(shí)驗(yàn)只是從TβRⅠ蛋白表達(dá)的角度為其參與癲癇發(fā)病機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。有關(guān)TβRⅠ在癲癇發(fā)病機(jī)制中的具體作用及詳細(xì)機(jī)制，還需要更多、更深入的研究證明。

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