豐富環境干預對短暫性全腦缺血大鼠學習記憶能力的影響

劉海燕， 藺 勇， 張 揚， 程永杰

隨著社會環境因素和飲食結構的改變，人類腦血管病的發病率和致殘率日益增加，其中缺血性腦血管病占腦血管病的80% ～85%［1］，嚴重地影響著人們的身體健康與生活質量。因此，尋求各種促進腦損傷后功能恢復的有利因素是目前研究的重點。

康復訓練已被認定是治療腦血管病的有效方法之一，其機制是基于腦的可塑性研究，即損傷后的腦組織在多因素的干預下其腦細胞功能得以恢復。以往的研究發現，大鼠對外界環境的認識依賴于視覺、觸覺、嗅覺、味覺、聽覺、平衡感覺等多種感覺刺激的信息輸入，中樞神經系統對這些傳入信號進行分析、整合、調整其結構以適應外界環境的變化。目前豐富康復訓練對學習記憶功能影響的研究鮮有報道。

因此，本研究通過觀察包含多感官刺激的豐富環境模型對短暫性全腦缺血大鼠學習記憶能力的影響，為臨床早期積極的環境療法治療腦缺血提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

健康雄性清潔級Wistar大鼠，3～4月齡，體重280±20g，由吉林大學實驗動物中心提供。

1.1.2 實驗儀器

腦立體定位儀，SDQ-30雙極射頻電凝器，Morris水迷宮自動監控儀，CE-0120型牙科鉆。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的制備與分組

所有大鼠隨機分為缺血組和假手術組。采用四血管阻斷法(4-VO)制備大鼠短暫性全腦缺血再灌注模型［2］。手術前晚大鼠禁食，自由進水。大鼠經10%水合氯醛(3.0～3.5ml/kg)腹腔麻醉后，背面頸正中切口，暴露雙側第一頸椎橫突翼小孔，用直徑0.5mm的電凝針插入雙側翼小孔，燒灼雙側動脈，造成永久性閉塞。然后腹面頸正中切口，鈍性分離雙側頸總動脈，穿線備用，縫合傷口。24h后在動物清醒狀態下，用微動脈夾夾閉雙側頸總動脈，即為缺血開始。大鼠首先出現短暫驚厥，瞳孔散大，眼球呈灰白色，翻正反射消失，腦電圖呈一直線。夾閉12min后松開動脈夾，恢復再灌注。整個手術過程中保持動物肛溫為37.0±0.5℃。缺血過程中翻正反射未消失或缺血時出現痙攣的大鼠淘汰。假手術組僅暴露4條血管，不夾閉雙側頸總動脈，其余步驟同上。術后手術部位施以適量青霉素抗感染，然后縫合，常規飼養觀察。

將術后出現體重明顯減輕，探索行為減少，反應遲鈍或激惹等情況的大鼠淘汰。各組隨機補充大鼠，列為本實驗研究對象。缺血組隨機分為豐富環境組(Ischemia+Enriched，IE)和標準環境組(Ischemia+Standard，IS)，假手術組亦隨機分為豐富環境組(Sham+Enriched，SE)和標準環境組(Sham+Standard，SS)，每組動物8 只。

1.2.2 干預方法

參照Puurunen等［3］方法設計不同環境。于術后第3 d開始干預，IE組和SE組每個籠內5～8只大鼠。此豐富環境為70cm×50cm×82cm的金屬有機玻璃，籠內放置不同顏色、形狀及氣味的物體，包括線鏈、秋千、積木、塑料管隧道、玻璃球、高低杠等“玩具”，以及有刺激性氣味的檸檬、薄荷棉球等。并播放輕音樂，以明暗彩光照射，每天持續1h。該籠每周更換1次，清潔后用新形狀、顏色、材料的物品替換，重擺物品的位置，總干預時間為14d。IS組和SS組則每個籠內1～2只大鼠，飼養于30cm×20cm×15cm的不透明標準籠內，不設有任何物體，也不給予上述任何刺激。所有大鼠置于室溫下飼養，自由飲水進食。各組以12h為周期進行明暗交替，所有行為測試均在暗周期進行。

1.2.3 大鼠學習記憶能力測試

改良的 Morris水迷宮［4］為一直徑 125cm，高50cm的圓池，池壁標有東、西、南、北4個入水點，將水池分為4個象限。將直徑8cm，高30cm的圓形透明平臺，隨機放置于圓池某一象限內固定位置。加水至水深32cm，使平臺頂低于液面2cm。將全脂奶粉放于水中混勻，使池水渾濁。加熱器維持水溫在22℃左右。訓練期間迷宮周圍參照物保持不變。

干預14d(即缺血28d)開始，各組大鼠開始進行Morris水迷宮實驗，訓練動物熟悉測試的環境。次日開始正式訓練，實驗分為兩部分:①定位航行實驗:用于測試大鼠學習和記憶的獲取能力。每天上、下午各1輪，每輪訓練4次，每只大鼠每次訓練60s，兩次訓練之間間隔30s，歷時4d。訓練時隨機選擇一個入水點，將大鼠面向池壁放入水中。觀察記錄動物60s觸到平臺的時間(逃避潛伏期)以及游泳路線的長度。②空間探索實驗:用于測試大鼠對空間位置記憶的保持能力。在5d下午撤除平臺，大鼠于原平臺對側象限入水，攝像機拍攝大鼠游泳軌跡，記錄其60s內尋找平臺的路線圖。

1.3 統計學處理

2 結果

缺血后28d開始，我們采用Morris水迷宮觀察了各組大鼠的空間學習記憶能力。此時距離全腦缺血發生已近5w，各組動物均無明顯神經缺陷癥狀;同時，訓練中它們的游泳速度也不存在顯著性差異，因此可以排除運動功能障礙本身對空間認知能力的影響。經過4d的認知訓練后我們發現，各組大鼠尋找平臺的逃避潛伏期，經由路程均逐漸縮短，這充分表明大鼠可以通過周圍環境中的空間線索形成對平臺位置的記憶。如表圖所示，在測試前3d，與IE組和假手術組相比，IS組動物找到平臺的逃避潛伏期延長(見表1)，經由路線增加(見表2)，但最終完成測試任務。IE組和假手術組之間比較，上述改變趨勢基本一致，缺乏統計學上的顯著性(P＞0.05)。以上結果提示，腦缺血后豐富環境干預可以提高其功能的自發性恢復。

表1 大鼠Morris水迷宮訓練過程中平均逃避潛伏期 ± s，s)

表1 大鼠Morris水迷宮訓練過程中平均逃避潛伏期 ± s，s)

與IE組和假手術組比較*P＜0.05

IE IS SE SS 36.08 ±2.7542.89 ±4.47*30.23 ±2.2535.66 ±2.5911.94 ±2.4818.11 ±2.7310.53 ±2.3111.14 ±2.117.77 ±1.668.56 ±1.786.97 ±1.539.01 ±1.895.71 ±1.286.46 ±1.444.98 ±1.237.24 ±1.56

表2 大鼠Morris水迷宮訓練過程中平均游泳路線長度 ± s，cm)

表2 大鼠Morris水迷宮訓練過程中平均游泳路線長度 ± s，cm)

與IE組和假手術組比較*P＜0.05

IE IS SE SS 1980.11 ±176.76*2480.56 ±198.112000.43 ±177.222001.21 ±177.771002.65 ±129.111234.01 ±131.551020.34 ±130.21900.87 ±128.97517.23 ±101.23520.11 ±101.41518.36 ±100.24516.44 ±99.51497.36 ±99.11500.11 ±100.36495.75 ±99.54490.86 ±98.69

3 討論

由于海馬在近期記憶的形成中起到關鍵性作用，缺血后的動物雖然遠期記憶不受影響，但卻會表現出對近期事件的順行性及逆行性遺忘;同時也很難形成新的關于語言或空間的記憶［5］。為了觀察短暫性全腦缺血對大鼠學習記憶能力的影響，我們在缺血發生后的第5周測試了各組動物的空間記憶能力，結果發現，雖然缺血組動物在潛伏期、游泳路線等指標方面的表現較比假手術組差，但這些差別卻都不顯著，表明歷時12 min的短暫缺血尚不足以造成大鼠空間學習記憶能力的明顯下降。這與文獻報道的結果相一致［4］。

不同環境刺激，會對腦的形態和功能產生不同的影響。本實驗顯示，經過豐富環境干預后，大鼠學習記憶能力得到加強，幾乎恢復到正常水平，而標準環境刺激的大鼠學習記憶能力有所減退，說明不同環境刺激對短暫性全腦缺血大鼠學習記憶能力的影響也不同。環境的豐富相對于標準環境而言，體現在空間、內部設置和成員組成上，由此提供不同的刺激，包括多感官、運動和社交刺激。標準環境的生活空間狹小、單調，各種感官刺激和活動非常有限，群體成員少，社交機會遭到剝奪。相反，豐富環境生活空間大，內置物體豐富而新奇，群體成員多，除了能夠提供充分的多感官、運動和社交刺激外，還能提供訓練學習的機會。學習記憶作為腦的高級活動之一，其實質就是復雜的信息獲取、傳遞與整合的過程。實驗中我們觀察到，在測試前3d，IS組動物較IE組和假手術組找到平臺的逃避潛伏期延長，經由路線增加。由此可見，各組大鼠在學習記憶能力上的差別可能正與其所處不同環境發出信息的質和量不同有關。豐富環境干預可以改善腦缺血大鼠的學習記憶能力。

［1］ 粟秀初，孟錦立.第16屆世界神經科學大會中有關缺血性中風的某些診療新觀點和措施簡介［J］.中風與神經疾病雜志，1998，15(2):125－127.

［2］ Pulsinelli WA，Brierley JB.A new model of bilateral hemispheric ischemia in the unanesthetized rat［J］.Stroke，1979，10(3):267 －272.

［3］ Puurunen K，Sivenius J.Influence of enriched environment on spatial learning following cerebral insult［J］.Rev Neurosci，2002，13(4):347－364.

［4］ Wiard RP，Dickerson MC，Beek O，et al.Neuroprotective properties of the novel antiepileptic lamotrigine in a gerbil model of global cerebral ischemia［J］.Stroke，1995，26(3):466 －472.

［5］ Squire LR，Zola SM.Ischemic brain damage and memory impairment:a commentary［J］.Hippocampus，1996，6(5):546 － 552.