基于DNA條形碼的廣西苦瓜中實蠅幼蟲分子鑒定研究*

姜 帆, 劉佳琪, 李志紅**, 吳佳教, 趙 朔

(1.中國農業大學農學與生物技術學院,北京 100193; 2.廣東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心,廣州 510623)

基于DNA條形碼的廣西苦瓜中實蠅幼蟲分子鑒定研究*

姜 帆1, 劉佳琪1, 李志紅1**, 吳佳教2, 趙 朔1

(1.中國農業大學農學與生物技術學院,北京 100193; 2.廣東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心,廣州 510623)

實蠅是多種熱帶、亞熱帶水果和蔬菜的重要害蟲,其卵、幼蟲、蛹難以通過形態特征進行種類鑒定。DNA條形碼是近年來出現的物種分子鑒定技術,能夠實現對昆蟲非成熟蟲態的快速鑒定。本研究利用DNA條形碼技術和BOLD系統,選取線粒體DNA細胞色素氧化酶I(COI)基因片段,針對采自于廣西南寧地區苦瓜中的實蠅幼蟲樣品進行了序列測定、比對和分析。結果顯示,在所檢測的10頭實蠅幼蟲樣品中,有4頭為瓜實蠅[Bactrocera cucurbitae(Coquillett)]、6頭為南亞果實蠅[Bactrocera tau(Walker)]。

實蠅; 幼蟲; DNA條形碼;COI基因; 分子鑒定

*致 謝: 感謝廣西出入境檢驗檢疫局李偉豐、李樹慶、龔秀澤等在樣品采集過程中給予的大力支持。

**通信作者 Tel:010-62733000;E-mail:lizh@cau.edu.cn第1作者與第2作者對本文為同等貢獻

實蠅是重要的果蔬害蟲之一,也是國際上重要的檢疫性害蟲,近年來口岸截獲的實蠅數量和批次有大幅上升的趨勢[1]。廣西地處亞熱帶,生態環境復雜,與相鄰東盟國家的果蔬貿易頻繁,給實蠅的傳播提供了有利條件,控制實蠅蔓延已經是當地植檢工作的重要課題。2000-2004年廣西檢驗檢疫局組織各口岸局開展了全區實蠅檢測工作,4年多來共設監測點1 940個,連續采集了廣西不同地區、不同季節和不同寄主環境下的實蠅25萬頭。經鑒定,共有橘小實蠅等26種,其中橘小實蠅、瓜實蠅、南亞果實蠅3個種是廣西的優勢種,發生普遍,數量也較多,基本分布于全區各地[2]。

傳統的物種鑒定工作主要依靠形態學特征,但由于區分不同實蠅種類之間的形態學差別往往非常細微和復雜,僅有少數專家能夠對關系緊密、親緣較近的實蠅種類進行準確的區分。同時,由于口岸截獲的實蠅很多情況下并非成蟲,不表現種水平的區分特征,只有等培養成熟后才能被準確鑒定[3],極大地降低了檢疫工作的時效性。

近年來,隨著DNA檢測和分析技術的快速發展,各種分子生物學手段被廣泛應用于實蠅的種類鑒定,如RFLP、AFLP以及DNA測序等[4],而通過測定某個或某幾個基因的部分序列來進行種類鑒定和區分的DNA條形碼(DNA barcode)技術也得到了迅速的發展和使用[5]。這一技術可以讓非專業人員在很短時間內準確、經濟地對目標物種進行鑒定[6]。線粒體DNA上的細胞色素氧化酶I(COI)基因的100～650 bp被證實能對很多動物物種進行高效區分[7],是進行DNA條形碼分子鑒定的首選目的基因。

BOLD(the barcode of life data)系統是為DNA條形碼的獲得、儲存、分析及發表提供幫助的信息平臺(http:∥www.boldsystems.org/views/login.php)。通過整合生物分子、形態、區域分布的數據,該系統在各類生物信息之間建立了聯系。用戶通過BOLD可以在全球基因序列數據庫中免費獲得DNA條形碼序列[8]。BOLD系統目前記錄了動物界、植物界、真菌界、原生生物界共118 204種生物的DNA條形碼,其中記錄的517種實蠅科昆蟲中,Dacinae亞科、Tephritinae亞科和Trypetinae分別占197、195種和113種,在Dacinae亞科中,Bactrocera、Ceratitis和Dacus為記錄較多的3個屬,分別為 83、34、50種。

本研究應用 DNA條形碼分子鑒定技術,對2009年采自于廣西南寧地區苦瓜果實中的實蠅幼蟲樣品進行了mtDNACOI基因片段的序列檢測,與BOLD系統中的標準序列進行了比對和系統發生分析,并得到了分子鑒定結果。

1 材料與方法

1.1 樣品

本研究所用實蠅試材采自于廣西壯族自治區南寧地區一苦瓜菜園的多個苦瓜果實,通過剖果采集。實蠅幼蟲樣品共計10頭,采集后液浸于100%的乙醇中并低溫保存。

1.2 成蟲誘集

本研究采用廣東出入境檢驗檢疫局提供的誘捕器和誘餌對上述地區的實蠅成蟲進行監測。Steiner式誘器中添加橘小實蠅引誘劑(Me)或瓜實蠅引誘劑(Cue),每個誘捕器為一種引誘劑;Mcphail式誘器中加蛋白誘餌。

1.3 DNA提取

依據李云龍[9]方法,采用天根生化科技(北京)有限公司的“血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒”,進行實蠅幼蟲總DNA的提取。

1.4 PCR擴增及序列測定

擴增的目的片段是mtDNA中COI基因總長度為615 bp的一段序列,擴增引物參考Folmer所使用的LCO-1490和HCO-2198[10],由北京奧科生物科技有限公司合成,信息如表1所示。

表1 引物序列信息

PCR 反應的總體積為52 μ L,具體包含:6.0 μ L 10 ×buffer緩沖液,3.0 μ L MgCl2,2.0 μ L dNTPS,0.4 μ LTaqDNA 聚合酶 ,上下游引物各 3.0 μ L,ddH2O 32.6μ L,DNA 模板 2.0 μ L。反應條件為94℃加熱3 min,然后進行39次PCR循環:94℃變性1 min,50℃退火1 min,72℃延伸1 min,最后72℃延伸10 min,PCR產物保存于4℃。2%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產物,EB染色檢測。

委托北京奧科生物技術公司進行純化并進行雙向測序,測序均在ABI-3730測序儀上進行。

1.5 序列比對和分析

雙向序列返回后,由DNAMAN軟件對每一樣品正反向測序的結果拼接,得到單條準確序列。然后在BOLD(barcode of life date systems v2.5)數據庫中的identify specimen功能進行相似性比對,以確定所擴增的615 bp序列的種群,然后查看鑒定結果(identification summary)以及相似性數據(distance summary),最后利用PAUP 4.0軟件采用最大似然法(ML)、鄰接法(NJ)和簡約法(MP)構建所檢測的10個實蠅樣品與BOLD、GenBank數據庫中相關種實蠅的系統發育樹,以核實確定鑒定的結果。

2 結果

2.1 成蟲誘集結果

所誘集到的成蟲全部為瓜實蠅和南亞果實蠅。

2.2 PCR擴增結果

PCR產物經凝膠電泳檢測后含有615 bp特異片段的PCR粗產物,結果如圖1所示,其中第1泳道為Marker,第11泳道為陰性對照。

圖1 實蠅幼蟲COI基因擴增結果

2.3 序列測定結果

經過正反向拼接、同物種序列比對和手工校正,最終得到了長度為615 bp的高質量COI序列10條。

2.4 相似性比對鑒定結果

經BOLD的分子鑒定結果為:瓜實蠅有4頭,對應上述PCR擴增結果的第4、5、7、8泳道,與 BOLD中 瓜 實 蠅 GBDP1754-06、GBDP2095-06、GBDP2100-06、GBDP2095-06比對的相似性分別為100%、100%、99.84%、100%;南亞果實蠅為 6頭,對應上述PCR 擴增結果的第2、3、6、9、10、12泳道,與BOLD中南亞果實蠅MVTBI310-09的相似性分別為 100%、100%、100%、99.66%、99.83%、100%。

圖2 ML法構建的未知種及其相關種系統發育樹

將相似度非100%的第7、第 9、第10泳道的序列提交GenBank,獲得注冊號分別為:HM590447、HM590448、HM590449。

2.5 系統發育樹

利用PAUP 4.0軟件,分別采用最大似然法、鄰接法和簡約法構建各條序列與BOLD、GenBank數據庫序列之間的系統發育樹,分屬各物種的個體的聚集趨勢十分顯著,這表明同一物種的個體可以和其他物種的個體很好地區分開,而結果也驗證了前面分子鑒定的結論。

2.6 結論

通過分子鑒定以及系統發育樹的確認,從苦瓜果實中提取的10頭實蠅幼蟲為南亞果實蠅和瓜實蠅共存,其中南亞果實蠅6頭,瓜實蠅4頭。所鑒定的實蠅幼蟲種類與本試驗的成蟲誘捕結果相吻合,同時也與當地的實蠅優勢種群及寄主一致[2,11]。

3 討論

通過進行線粒體DNA上COI基因615 bp序列的測定和比較分析,廣西南寧苦瓜園苦瓜果實中采集的實蠅幼蟲得到了成功的鑒定和區分。因此本研究得到的序列完全可以作為DNA Barcode序列補充進入BOLD系統,同時本研究在今后也完全可以應用于一線口岸的實際檢疫工作中,這種方法的推廣在保證物種鑒定準確性的同時,將大大降低非成蟲態對象在實際工作中的檢疫難度,提高通關效率。同時,本研究也進一步驗證了基于COI基因的可變位點特征,615 bp甚至更短的片段序列即可以對物種達到區分效果[12],從而實現有關物種的快速、準確鑒定。

在使用BOLD系統的序列構建系統發育樹的時候,我們也發現有時會出現部分物種和系統發育結果不一樣的位置。這說明barcode并不能代替傳統的系統發育分析,利用BOLD系統構建的系統發育樹可以作為分子鑒定的補充,但并不能直接視為相應物種在進化上的系統發生關系,這和之前的很多研究結果是一致的[13]。

各種DNA分子標記已經被廣泛應用于親子鑒定和個體識別領域[14],在實蠅分子鑒定領域也有了許多應用和進展[15]。本研究的思路在今后的檢疫工作中同樣具有重要的開發價值,相信隨著中文實蠅條形碼數據系統的進一步研究以及有關物種線粒體DNACOI基因序列的進一步積累,最終將幫助我們實現實蠅種群更加快速、準確、經濟的分子鑒定。

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Molecular identification of fruit fly larvae by DNA barcodes

Jiang Fan1, Liu Jiaqi1, Li Zhihong1, Wu Jiajiao2, Zhao Shuo1
(1.College of Agronomy and Biotechnology,China Agricultural University,Beijing100193,China;2.Inspection and Quarantine Technology Center,GuangdongEntry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Guangzhou510623,China)

Fruit fly(Diptera:Tephritidae)is an important pest of a variety of tropical and subtropical fruits and vegetables,while species identification at its egg,larvae and adult stages is difficult by morphological characteristics.Emerging as a promising molecular technology of species identification,DNA barcodes can realize rapid identification of the immatures.Based on the DNA barcoding and BOLD system,a series of studies,including sequencing,alignment and analysis,were conducted based on the mitochondrial cytochrome oxidase subunit I(COI)gene using fruit fly larvae samples collected from balsam pear in Guangxi.The results showed that four of the ten larval specimens wereBactrocera cucurbitae(Coquillett),and six of them areBactrocera tau(Walker).

fruit fly; larva; DNA barcode;COIgene; molecular identification

S 436.42

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2011.04.033

2010-05-25

2010-06-31

農業部“引進國際先進農業科學技術”項目(2009-Z41);國家公益性行業(農業)專項(200903034);國家自然科學基金(30771432)