黑龍江省黑河市周邊地區奶牛乳房炎病原菌的分離鑒定與藥敏試驗

文 / 朱少奇 喬 潔 黑龍江省黑河市畜牧獸醫局

奶牛乳房炎是乳腺受到物理、化學、微生物等因素的刺激所發生的一種炎癥變化，是一種多因素疾病綜合征。

奶牛乳房炎是目前危害奶牛養殖業的主要疾病之一，每年可造成巨大的經濟損失[1]。雖然有多種病原微生物可引起奶牛乳房炎，但國內外公認的最常見、最主要的病原為金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、乳房鏈球菌、停乳鏈球菌和大腸桿菌等腸桿菌[2]。長期以來，牛場獸醫對奶牛乳房炎的治療以抗生素治療為主，但常規抗生素治療的結果并不理想。為進一步了解奶牛乳房炎病原菌的發展變化趨勢以及設計具有針對性的治療方案，本文對黑龍江省黑河市璦琿區4 個規模化牛場的奶樣進行了微生物學調查和藥敏試驗，以期為乳房炎的防治提供一些理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 奶樣

以黑龍江省黑河市璦琿區四嘉子鄉、河南屯鄉以及幸福鄉的4 個奶牛養殖小區作為試驗基地，選取隱性乳房炎（BMT陽性）或臨床型乳房炎患牛發病乳區100 個，于采取治療措施之前，對發病乳區乳頭嚴格消毒，采集奶樣（2 mL/乳區）至無菌管內。

1.1.2 培養基

犢牛血清、營養肉湯、營養瓊脂、高鹽甘露醇瓊脂、7%羊血瓊脂、麥康凱瓊脂、MH 瓊脂、氧化酶、馬尿酸鈉、山梨醇、七葉苷、生化管（成套）、微量發酵管，均購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.1.3 標準菌株

金黃色葡萄球菌ATCC25923 （β溶血）、大腸桿菌ATCC25922，購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.1.4 藥敏紙片

青霉素G、頭孢噻肟、先鋒V、先鋒VI、阿米卡星、卡那霉素、四環素、環丙沙星、阿奇霉素、氨芐青霉素、鏈霉素，均購自哈爾濱生物制藥一廠。

1.1.5 診斷試劑

隱性乳房炎診斷液（簡稱LMT），購自蘭州中獸醫研究所。

生1：我把幾何圖形分為兩類，一類是立體的，比如：長方體、正方體、圓柱、圓錐、球、棱柱、棱錐等；一類是平面的，比如：正方形、長方形、圓、三角形等．

1.2 試驗方法

1.2.1 奶樣采集

選取隱性乳房炎陽性（經BMT對所選奶牛進行隱性乳房炎檢測）乳區或臨床型乳房炎乳區100 個。用75%酒精溶液消毒乳頭孔處后，傾斜帶無菌棉拭子的試管，將管口對準乳頭孔，采集乳汁3～5 mL。采樣過程嚴格無菌操作。

1.2.2 微生物分離培養

分別將無菌采集的隱性乳房炎或臨床型乳房炎乳樣搖勻，吸1 mL加入到10 mL含5%犢牛血清的營養肉湯中，同時用接種環無菌取樣涂布于羊血瓊脂平板，37 ℃培養24～48 h。將平板上的單個典型菌落（如未見菌落生長則用肉湯培養物接種到羊血瓊脂平板，37 ℃ 培養18～24 h）分別接種到鑒別培養基中，37 ℃ 培養18～24 h 。觀察菌落形態、生長特征，經革蘭氏染色后進行鏡檢，并通過觸酶、氧化酶試驗進行純檢，初步判定細菌種類。

1.2.3 細菌生化鑒定

根據初步鑒定結果，對分離到的菌株有選擇地進行生化試驗。中等大小G-桿菌，接種于三糖鐵培養基，再用腸桿菌科細菌生化編碼鑒定管GYZ—15e 進行生化鑒定；G+葡萄球菌按葡萄球菌屬細菌生化編碼鑒定管TH—16s進行生化鑒定；G+鏈球菌進行CAMP試驗及鏈球菌生化鑒定，包括馬尿酸鈉水解試驗，甘露醇、山梨醇和七葉苷發酵試驗等。

1.2.4 藥敏試驗

藥敏試驗采用紙片擴散法，將經過鑒定的菌株各隨機選擇4 株，接種于營養肉湯純培養液，37 ℃ 培養18～24 h ，滴加1 mL培養液于血瓊脂平板表面，用“L”形涂布棒均勻涂布。待平板表面稍干燥后，用無菌鑷子夾取抗菌藥物紙片，按一定距離分別貼于平板上，置37 ℃ 恒溫培養24 h 后取出，用游標卡尺測量各藥的抑菌環直徑。計算同一類菌不同菌株的平均抑菌直徑。直徑小于16 mm為不敏感，16～20 mm為中度敏感，大于20 mm為高度敏感。供試驗藥物為青霉素G、頭孢噻肟、先鋒V、先鋒VI、阿米卡星、卡那霉素、四環素、環丙沙星、阿奇霉素、氨芐青霉素和鏈霉素。

表1 100 個奶牛乳房炎陽性奶樣細菌鑒定結果

2 結果

2.1 細菌的培養特性和形態觀察

在營養瓊脂平板、血平板、高鹽甘露醇瓊脂平板上生長良好，菌落形態為圓形、濕潤、突起、光滑、邊緣規則的淡黃色小菌落；在血平板上見明顯溶血；在麥康凱瓊脂平板上不生長；在肉湯中渾濁、沉淀，并在管壁形成菌環；革蘭氏染色為G+，呈葡萄串狀、成雙或單個排列的球菌，可初步判斷為金黃色葡萄球菌。

在營養瓊脂生長不良，在羊血平板上生長良好，可見圓形、灰白色、突起、光滑、較濕潤小菌落，多呈β型溶血；觸酶試驗陰性，CAMP 試驗陽性；革蘭氏染色為鏈狀、短鏈狀或成雙排列的G+圓型或卵圓型球菌，可初步判斷為鏈球菌。

在營養瓊脂平板上生長良好，形成圓形、乳白色、突起、光滑、較濕潤中等大小菌落，麥康凱瓊脂平板上呈紅色；革蘭氏染色為G-桿菌，可初步判斷為大腸桿菌。

2.2 細菌生化鑒定

根據觸酶試驗、凝固酶試驗陽性，參考《葡萄球菌屬細菌生化鑒定編碼冊（TH-16s）》（杭州市天和微生物試劑有限公司）中規定的生化培養鑒定指標進行鑒定。觸酶試驗、凝固酶試驗陽性，能分解葡萄糖、麥芽糖、蔗糖，產酸不產氣，發酵甘露醇，硝酸鹽、V-P陽性，溶血明顯，可判斷為葡萄球菌。

發酵葡萄糖、乳糖、蔗糖，不發酵山梨醇、棉籽塘；水解馬尿酸鈉、水楊苷、膽汁，不水解明膠、七葉苷；CAMP、吲哚試驗陽性，V-P試驗、甲基紅、觸酶試驗陰性，可判斷為無乳鏈球菌。

根據CAMP 試驗結果，以及水解七葉苷（非發酵）和馬尿酸鹽的能力區分無乳鏈球菌、停乳鏈球菌和乳房鏈球菌。無乳鏈球菌不水解七葉苷（非發酵），水解馬尿酸鹽，CAMP 試驗陽性；停乳鏈球菌不水解七葉苷（非發酵）和馬尿酸鹽CAMP試驗陰性，非β型溶血；乳房鏈球菌的營養肉湯培養物呈均勻渾濁，能水解七葉苷（非發酵）和馬尿酸鹽，CAMP 試驗陰性。

當鏡檢為G-桿菌，觸酶試驗陽性，氧化酶陰性時，接種麥康凱瓊脂平皿、三糖鐵瓊脂斜面陽性后，根據《腸桿菌科細菌生化編碼鑒定冊（GYZ-15e）》（杭州市天和微生物試劑有限公司）中規定的生化培養鑒定指標進行鑒定，即在麥康凱瓊脂平皿菌落為粉紅色、V-P陰性、不分解尿素、構椽酸鹽陰性、MR 和吲哚陽性，三糖鐵產酸產氣即可判斷為大腸桿菌。

2.3 細菌分離鑒定結果

對100 個陽性乳樣進行細菌分離培養和鑒定，結果見表1。從表1中可以看出，在75 份血清中檢出10 種共89 個菌株，檢出率為75%（75/100），其中葡萄球菌33 株，占37.1%；鏈球菌33 株，占37.1%；大腸桿菌9 株，占10.1%。從表1中可以看出，葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌是采樣牧場引起乳房炎的主要致病菌。

2.4 藥敏試驗結果

對分離出的主要病原菌進行藥敏試驗，結果見表2。表2表明：病原菌基本上對青霉素G、鏈霉素產生耐藥性；金葡菌對阿奇霉素、卡那霉素、頭孢噻肟、先鋒V、氯霉素高度敏感；表皮葡萄球菌對頭孢噻肟、卡那霉素、阿米卡星高度敏感；無乳鏈球菌對氯霉素、四環素、阿米卡星高度敏感；停乳鏈霉菌對氨芐青霉素、卡那霉素、先鋒VI、頭孢噻肟高度敏感。乳房鏈霉菌和大腸桿菌只對環丙沙星和先鋒V敏感。病原菌對本試驗其余藥物中度敏感。

3 討論

從奶牛乳房炎病原菌分離鑒定結果可以看出，采樣牧場引起奶牛乳房炎的主要病原菌是葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌。這與黑河周邊地區奶牛養殖現狀密切相關。飼料營養失衡、管理不善、欄舍潮濕、養殖小區衛生條件差、擠奶設備維護保養不及時或消毒不徹底都會引起乳房炎發生。因而，實際生產中應切實加強牛群飼養管理與擠奶設備的維護。

藥敏試驗結果顯示，不同來源的分離菌株對頭孢噻肟、先鋒V、先鋒VI、阿米卡星、卡那霉素、氯霉素高敏；但對四環素、環丙沙星、阿奇霉素、氨芐青霉素已出現耐藥趨勢；青霉素G、鏈霉素對所有菌株已幾乎無效。以上結果，一方面表明了當前本地奶牛乳房炎的治療首選藥物主要有以上6 種；另一方面，由于抗菌藥物的廣泛應用，耐藥菌株的數量愈來愈多[3]。在防治奶牛乳房炎時，臨床用藥要注意按規定的劑量與療程使用，及時更換不同的敏感藥物進行治療，以免產生過多的耐藥現象，不利于今后的治療，而且還會影響人類用藥及身體健康。■

表2 藥敏試驗結果

[1]卜仕金. 奶牛乳房炎的抗菌藥物防治. 獸藥與飼料添加劑，1999，4（3）：14-16.

[2]袁永隆，張禮華，劉春傳，等. 我國奶牛乳房炎常見病原菌的區系調查. 中國農業科學，1992，25（4）：70-76.

[3]孔雪旺，陳功義. 奶牛乳房炎病原菌的分離鑒定與藥敏試驗. 中國奶牛，2007（1）：43-44.