巨噬細胞移動抑制因子經Rho途徑促進人肺成纖維細胞Ⅰ型膠原合成*

陳培芬 羅雅玲 賴文巖 邢曉雯 譚家余 駱子義 邱智輝

1 廣東省深圳市第三人民醫院內科 5180114; 2 南方醫科大學附屬南方醫院呼吸科3 心內科實驗室; 4 廣州醫學院附屬第一醫院心內科

氣道重塑是哮喘具有特征性的病理改變之一。哮喘患者增厚的基底膜層主要是由Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ膠原纖維和成肌纖維細胞產生的纖維連接蛋白組成[1]。Ⅰ型膠原的沉積促使管壁增厚和僵硬,被認為是早期氣道重塑的重要指標[2]。巨噬細胞移動抑制因子(macrophage MIg ration inhib itory facto r,MIF)是體內一種重要的多功能細胞因子,具有促炎、免疫調節等功能。循環血中的嗜酸性粒細胞在佛波酯或白介素-5的刺激下可分泌MIF[3]。國外的研究提示MIF在哮喘氣道炎癥中起重要作用[4,5]。新近的研究提示MIF在氣道重塑中起重要作用[6],但具體機制未明。本研究探討了MIF在人胚肺成纖維細胞Ⅰ型膠原合成中的作用及其途徑以初步探討其在氣道重塑中的機制。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑 M RC-5細胞株購自中國科學院上海細胞生物學研究所;DM EM培養基為Gibco公司產品;胎牛血清購自PAA公司;recombinan t MIF(rMIF)、TGF-β1ELISA試劑盒購自 R&D 公司;T rizo lRNA抽取試劑為Invitrogen公司產品,逆轉錄試劑盒購自 Fermen tas生物技術有限公司;PCR引物由上海英駿公司合成;鼠抗人Ⅰ型膠原抗體購自San ta Cruz;H RP-兔抗鼠IgG(Ⅱ抗)購自北京博奧森生物技術有限公司;Rho激酶抑制劑Y27632購自BioSource公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及分組。M RC-5細胞培養于加入10%胎牛血清的DM EM 培養液中,放置于37℃、5%CO2培養箱中。實驗分為實驗組和對照組,實驗組分別加入100μg/L的 rMIF。

1.2.2 RT-PCR方法檢測Ⅰ型膠原m RNA的表達。使用6孔板,對照組和實驗組孵育完成后收集細胞,T rizol提取總RNA,用紫外分光光度計檢測純度。反應分2步進行:取5μl總RNA,在M-M LV逆轉錄酶作用下合成DNA;再取1μl逆轉錄產物進行PCR擴增反應。Ⅰ型膠原上游引物為5'-GCTGGCTACTTCTCGCTCTG-3',下游為5'-AGCAGT TGGAGGCTGTGGG-3',產物大小267 bp;GAPDH上游引物為5'-ACCACAGTCCATGCCA TCAC-3',下游引物:5'-TCCACCACCCTGTTGCTG TA-3',產物大小450 bp。PCR反應條件:94℃預變性 5 MIn,94℃ 1MIn,53℃ 45s,72℃1MIn,進行36個循環,最后72℃延伸10MIn。每一PCR反應重復3次。PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳分離,紫外透射反射儀觀察擴增產物的大小及亮度并攝影。使用IPP 6.0圖像分析軟件對擴增條帶進行分析,以平均灰度值代表相應基因的表達量,并除以GAPDH灰度值,所得數值作為各擴增產物m RNA的相對表達量。

1.2.3 Western b lo tting檢測Ⅰ型膠原蛋白表達。用預冷PBS洗細胞3次,加入200μl蛋白裂解液,刮起細胞,4℃12 000×g離心15MIn,吸取上清,BCA法測定總蛋白濃度。取 40μg的上述樣品加樣至15%的SDS-PAGE凝膠,電泳,待溴酚藍接近凝膠底部時停止電泳,用轉移緩沖液把凝膠上蛋白質轉移至硝酸纖維膜上,膜在室溫下用5%脫脂奶粉封閉液封閉1h,加入1∶500稀釋的鼠抗人Ⅰ型膠原抗體及β-actin單克隆抗體于4℃孵育12h,然后加辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗(1∶10 000)室溫孵育1h,TBST洗膜后用ECL液顯影,以β-actin為內參照,用IPP6.0圖像分析軟件對Ⅰ型膠原蛋白進行半定量分析。

1.2.4 EL ISA法檢測培養上清中TGF-β1蛋白表達。取對數生長期M RC-5細胞1×103個接種于6孔板中,培養24h;換無血清培養基,繼續培養24h,使細胞進入生長靜止期;吸棄各孔培養基,換為終濃度為100μg/L rMIF的含10%胎牛血清的DM EM 2m l,分別培養 6、12、24、28h;分別收集細胞培養上清液,4℃下3 000×g離心10MIn,收集上清。按試劑說明書測定TGF-β1蛋白濃度。

2 結果

2.1 培養的M RC-5形態 如圖1所示,光鏡下見M RC-5細胞生長旺盛,分布密集,多呈長梭形、細胞走向趨于一致,近于排列,并有一定的弧形。高倍鏡下可見長梭形細胞的細胞體飽滿、有2～3個扁平而長的突起,細胞核較大,呈卵圓形且多居中。

圖1 人肺成纖維細胞M RC-5(×100)

2.2 rMIF對M RC-5培養上清 TGF-β1蛋白濃度的影響 如圖 2、表 1所示,與同一時間點未加rMIF的對照組比較,100μg/L的rMIF刺激M RC-5細胞 6h、12h、24h、48h 后,細胞培養上清中的TGF-β1濃度無顯著變化(P＞0.05)。

圖2 rMIF(100μg/L)刺激M RC-5細胞后不同時間點細胞培養上清 TGF-β1濃度(pg/m L)(±s,n=6)

2.3 100μg/L rMIF刺激促進M RC-5細胞Ⅰ型膠原m RNA轉錄,拮抗Rho激酶抑制此促進作用如圖3所示,100μg/L的rMIF刺激48h后,M RC-5細胞Ⅰ型膠原m RNA合成顯著增加(P＜0.01);Rho拮抗劑預刺激后,rMIF促進Ⅰ型膠原m RNA合成能力顯著減弱(P＜0.01)。

表1 rMIF(100μg/L)刺激 MRC-5細胞后不同時間點細胞培養上清TGF-β1濃度(pg/m L)(±s,n=6)

表1 rMIF(100μg/L)刺激 MRC-5細胞后不同時間點細胞培養上清TGF-β1濃度(pg/m L)(±s,n=6)

注:與對照組比較,P均＞0.05。

組別TGF-β1濃度(pg/m L)0h 6h 12h 24h 48h對照組 68.49±15.01 86.34±16.50 67.84±11.38 55.20±10.78 48.42±10.11 rMIF(100μg/L) 68.49±15.01 94.41±13.15 70.15±13.52 55.03±9.85 48.93±6.09

圖3 Y27632對rMIF刺激的 MRC-5細胞Ⅰ型膠原mRNA表達的影響

2.4 100μg/L rMIF刺激促進M RC-5細胞Ⅰ型膠原蛋白合成,拮抗Rho激酶抑制此促進作用 如圖4所示,100μg/L的rMIF刺激48h后,M RC-5細胞Ⅰ型膠原蛋白合成顯著增加(P＜0.01);Rho拮抗劑預刺激后,rMIF促進Ⅰ型膠原蛋白合成能力顯著減弱(P＜0.01)。

圖4 Y27632對rMIF刺激的M RC-5細胞Ⅰ型膠原蛋白表達的影響

3 討論

MIF既是一種細胞因子,又是一種源于垂體的激素,還可作為糖皮質激素生理活動的負反饋調節劑,具有廣泛的生物學功能的細胞因子。MIF可促進血管平滑肌細胞合成Ⅰ、Ⅲ型膠原m RNA和Ⅰ型膠原蛋白,參與高血壓血管重構[7],與動脈內膜增厚有關[8]。Sasaki等[9]發現MIF還可促進腎小球纖維化形成。提示MIF在膠原合成和器官纖維化中具有重要作用。以MIF拮抗劑ISO-1治療慢性哮喘小鼠,可減輕氣道重塑,提示MIF在氣道重塑中起重要作用[6]。但MIF如何參與該過程,機制未明。

成纖維細胞(fib rob last,FB)氣道黏膜下的主要結構細胞之一,其產生的膠原纖維、彈性纖維和網狀纖維等沉積于基底膜,使氣道壁進一步增厚。哮喘患者增厚的基底膜層主要是由Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ膠原纖維和成肌纖維細胞產生的纖維連接蛋白組成[1]。Ⅰ型膠原的沉積促使管壁增厚和僵硬,與α-平滑肌肌動蛋白一起被認為是早期氣道重塑的重要指標[2]。因此作者探討了MIF與Ⅰ型膠原合成之間的關系。本研究結果表明,rMIF可促進Ⅰ型膠原m RNA和蛋白合成。這提示MIF可能通過促進成纖維細胞Ⅰ型膠原合成而參與哮喘的氣道重塑。MIF導致M RC-5細胞Ⅰ型膠原表達增多的機制尚不清楚。最近發現,MIF可激活Rho激酶途徑[10]。在調控血管緊張素Ⅱ刺激大鼠心肌成纖維細胞增殖與膠原合成中,Rho激酶具有重要作用[11]。Rho相關卷曲螺旋形成蛋白激酶(Rho associated coiled coil forMIng pro tein kinase,ROCK)是Rho蛋白的下游靶效應分子之一。Y 27632是在細胞生物學和藥理學研究中廣為應用的ROCK抑制劑。本研究在rMIF刺激M RC-5細胞前預先用Y 27632處理,觀察其對rMIF促進Ⅰ型膠原合成中的影響。結果顯示,rMIF誘導M RC-5細胞Ⅰ型膠原合成的能力可被Y27632所抑制。由于Y 27632只特異性作用于Rho激酶,因此本結果提示Rho激酶信號通路可能參與了rMIF誘導的M RC-5細胞Ⅰ型膠原合成。

TGF-β1是一個很重要的促纖維化細胞因子,在哮喘氣道重塑中起重要作用。哮喘患者氣道TGF-β1表達增加,與病情的嚴重程度和上皮下纖維化程度相關[12]。TGF-β1可誘導鼠成纖維細胞向成肌纖維細胞轉化[13],增加膠原Ⅰ和Ⅲ合成而引起肺纖維化[14]。H o lgate等報道TGF-β1可促進成纖維細胞增殖、膠原合成、細胞外基質積聚及向肌成纖維細胞表型分化[15,16]。在人細胞上,Batra等[17]的研究提示TGF-β1的促纖維化機制是通過提高成纖維細胞生長、膠原產生和促進成纖維細胞轉化成成肌纖維細胞以產生更多的膠原和細胞外基質等而實現的。本研究也探討了rMIF刺激M RC-5細胞后TGF-β1的表達。結果顯示,100μg/L的 rMIF刺激 6h、12h、24h、48h后,細胞培養上清中的 TGF-β1濃度無顯著變化。這提示 rMIF誘導M RC-5細胞膠原合成可能與TGF-β1的作用無關。之前筆者在哮喘小鼠肺中觀察到 TGF-β1表達增加,拮抗MIF可使小鼠TGF-β1表達下調[6],與本實驗結果不大一致。究其原因有:(1)rMIF未影響到M RC-5細胞培養上清中TGF-β1蛋白水平,但未必不影響其m RNA和細胞內蛋白水平,應進一步檢測上述2個指標;(2)巨噬細胞、上皮細胞、成纖維細胞和EOS均能分泌TGF-β1。rMIF對M RC-5分泌TGF-β1無影響,但不能除外影響巨噬細胞、上皮細胞、EOS等分泌 TGF-β1進而影響了哮喘小鼠肺TGF-β1的表達;(3)體內實驗和體外實驗的差別。究竟何種原因所致有待進一步研究。

總之,MIF可能通過Rho途徑刺激成纖維細胞膠原Ⅰ型合成從而在哮喘氣道重塑的發病機制中發揮重要作用。

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