布魯氏菌環介導等溫擴增（LAMP）可視化檢測方法的建立

許鄒亮 ，南文龍 ，周 潔 ，陸明哲 ，郭玉廣 ，譚鵬飛 ，毛開榮 ，彭大新 ，陳義平

（1.中國動物衛生與流行病學中心診斷液研究室，山東青島 266032；2.揚州大學獸醫學院，江蘇揚州 2250093；3．中國獸醫藥品監察所，北京 10081）

布魯氏菌?。˙rucellosis）是由布魯氏菌（Brucella）引起的一種人畜共患傳染病，可引起流產、不孕和各種組織的局部病灶[1]。本病廣泛分布于世界各地，家畜中牛、羊、豬最常發生，給畜牧業發展和人類健康都帶來嚴重危害。近年來，我國人布魯氏菌感染率呈現明顯回升趨勢[2-3]。

目前，布魯氏菌病診斷技術主要有虎紅平板凝集試驗（RBT）、試管凝集試驗（SAT）、乳環試驗（MRT）、補體結合試驗（CFT）、ELISA和PCR等方法[4]。2000年，Notomi等開發了環介導等溫擴增技術（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP），該方法具有靈敏性高、特異性好、反應時間短、判定結果方便、不需要昂貴儀器等優勢，并開始廣泛應用于病毒病、細菌病、寄生蟲病的診斷[5-7]。本研究建立了布魯氏菌LAMP可視化快速檢測方法，為基層簡便、快捷臨床檢測布魯氏菌奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

Bst DNA聚合酶、AgeⅠ限制性內切酶購自New England Biolabs公司；甜菜堿、MgSO4、羥基萘酚藍（HNB）、鈣黃綠素和蛋白酶 K購自Sigma公司；dNTP、DL 2000 Marker等購自寶生物工程（大連）有限公司；QIAamp DNA Mini Kit購自QIAGEN公司；布魯氏菌標準疫苗株S19、104M、M5和S2由本室保存；牛種布魯氏菌544A（B.abortus 544A）、羊種布魯氏菌16M（B.menlitensis 16M）、豬種布魯氏菌S1330（B.suis 1330）、綿羊附睪種布魯氏菌 63/290（B.ovis63/290）、 犬 種 布 魯 氏 菌 RM6/66（B.canis RM6/66）由中國獸醫藥品監察所饋贈；豬大腸桿菌K99、巴氏桿菌C48-1、豬鏈球菌ST171、綠膿桿菌等由本室分離保存；牛布魯氏菌病RBT陽性血清樣本采自布魯氏菌流行區。

1.2 LAMP引物的設計與合成

根據GenBank中的布魯氏菌外膜蛋白OMP25基因序列，利用PrimerExplorer V4設計一套LAMP引物，其中F3/B3為外引物，FIP/BIP為內引物，LF/LB為環引物；B4/B5為布魯氏菌PCR檢測引物[8-10]（表1）。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，用ddH2O溶解后分裝，-20℃冰箱保存備用。

表1 檢測布魯氏菌的引物序列

1.3 細菌基因組DNA的提取

從甘油葡萄糖瓊脂平板上用0.5%的苯酚生理鹽水將培養好的布魯氏菌洗下，濾液放入70℃水浴鍋滅活1 h。吸取600 μL的細菌培養物，5000 r/min離心5 min，棄上清。沉淀用540 μL的TE/sodium緩沖液重懸，然后加入 30 μL 10%（w/v）SDS、3 μL 2%（w/v）蛋白酶K，混合后37℃溫育1 h。用酚氯仿對裂解細胞抽提2次，12000 r/min離心2 min，取上清，加入2倍體積預冷的無水乙醇，12000 r/min離心1 min，沉淀溶解在100 μL的TE緩沖液中。測定DNA模板濃度及純度，-20℃冰箱保存備用。

1.4 LAMP反應體系的建立

優化反應條件，建立 25 μL 反應體系：2.5 μL 10×Thermopol buffer、4 μL MgSO4（50 mM）、1.5 μL dNTPs （25 mM）、4 μL 甜菜堿（5 M）、1 μL Bst DNA polymerase （8 U/μL）、1 μL F3/B3 （5 μM）、1.5 μL FIP/BIP（20 μM）、1 μL LF/LB（20 μM）、1 μL HNB（3 mmol/L）、2 μL Template DNA 和 3 μL ddH2O。63 ℃恒溫反應60 min，反應結束后根據顏色變化觀察結果。

1.5 LAMP產物的酶切鑒定

建立 25 μL 體系酶切體系：2.5 μL 10×NE Buffer、1 μL AgeⅠ內切酶、2 μL LAMP 反應產物、14.5 μL ddH2O，37 ℃反應 2 h，反應結束后取 5 μL 酶切產物電泳鑒定。

1.6 LAMP方法靈敏性檢測

B.abortus 544A的基因組DNA模板經測定濃度后，進行10倍系列稀釋，使得濃度梯度依次為85 ng/μL、8.5 ng/μL、850 pg/μL、85 pg/μL、8.5 pg/μL、850 fg/μL、85 fg/μL、8.5 fg/μL、850 ag/μL 和 85 ag/μL。分別取2.0 μL作為LAMP反應模板，每個梯度進行三個重復。反應結束后，直接肉眼觀察反應管內顏色變化進行結果判定并通過電泳驗證。

1.7 LAMP方法特異性檢測

分別提取牛種布魯氏菌544A、104M和 S19、羊種布魯氏菌16M和M5、豬種布魯氏菌S1330和S2、綿羊附睪種布魯氏菌63/290、犬種布魯氏菌RM6/66以及豬大腸桿菌K99、巴氏桿菌C48-1、豬鏈球菌ST171、綠膿桿菌的基因組DNA模板，進行LAMP擴增，檢驗LAMP方法的特異性，反應結束后直接肉眼觀察反應管內顏色變化進行結果判定。

1.8 臨床樣本檢測

按QIAamp DNA Mini Kit操作說明書分別從60份牛布魯氏菌病RBT陽性血清樣本中提取DNA，各取2 μL的DNA進行LAMP和B4/B5-PCR檢測，比較兩種檢出方法的陽性檢出率、符合率。PCR反應體系為 12.5 μL 2×Premix Taq Version 2.0，B4、B5（20 μM）各 0.5 μL 以及 2 μL 模板。PCR 反應程序是：先95℃解鏈 3 min；而后依次94℃20 s、60℃30 s、72℃30 s，共計 35 個循環；最后 72℃延伸 10 min。擴增產物通過1.5%凝膠電泳進行檢測。

2 結果

2.1 LAMP產物的酶切鑒定

如圖1所示，AgeⅠ特異性酶切后得到176 bp、218 bp和263 bp的條帶，與理論分析相符，證明LAMP擴增片段特異。

2.2 LAMP可視化檢測方法的靈敏性

將10倍遞進稀釋的B.abortus 544A的基因組DNA加入反應液中，于63℃恒溫下反應60 min。結果如圖2所示，發生LAMP擴增時，反應液變為天藍色，未發生LAMP擴增的仍為紫色。取反應產物進行電泳，結果呈天藍色的反應產物電泳時均出現階梯狀條帶，表示出現LAMP擴增反應（圖3），其顏色變化情況與電泳結果一致，可以判定本方法的檢測極限約為17 fg。

2.3 LAMP可視化檢測方法的特異性

對9株布魯氏菌和4株陰性對照菌基因組DNA進行LAMP擴增，結果如圖4所示，9株布魯氏菌反應管均呈天藍色，為陽性結果，4株陰性對照菌反應管均呈紫色，為陰性結果。

2.4 臨床樣本檢測

用建立的LAMP可視化檢測方法對60份RBT陽性的血清樣本進行檢測，并與B4/B5-PCR平行檢測的結果進行比較。結果如表2所示，B4/B5-PCR檢測為陽性的43份樣品經本方法檢測全部為陽性，B4/B5-PCR檢測為陰性的17份樣本，經本方法檢測，其中9份為陽性，8份為陰性，兩種方法的結果符合率為85.0%。

表2 臨床檢測結果（共60份陽性血清樣本）

3 討論

目前，在LAMP反應不開蓋的前提下，其結果判定方式主要有目視檢查渾濁、目視檢查染料顏色變化和濁度儀對LAMP反應進行實時監控這三種方法[11]。目視檢查渾濁法主要依據LAMP反應產生了大量的副產物焦磷酸鎂白色沉淀而使反應液呈現渾濁，但是當渾濁度較低時，肉眼很難察覺。利用實時濁度儀能夠更加直觀、精確地判定結果，但是需要使用特定的儀器設備。相比較而言，染料比色分析既提高了肉眼的識別率，又可直接用于疫病的現場診斷，是最為簡單方便的LAMP結果判定方式。目前，用于LAMP研究常見的染料主要有SYBR Green I、溴化乙錠（EB）、Picogreen、鈣黃綠素和HNB等，其中以SYBR Green I和HNB的檢測靈敏性最高，是鈣黃綠素的10倍[12]。然而SYBR Green I需在LAMP反應結束后加入，增加了擴增產物污染的可能。本研究采用的HNB染料于反應前加入，穩定性好，且陰陽性結果顏色差別明顯，易于判斷。

LAMP方法是一種高靈敏性的檢測方法，其靈敏性通常比PCR高出10～1000倍，達到甚至高于熒光定量PCR的檢測水平[11，13]。在分析LAMP反應結果時，本試驗采用HNB染料比色并進行電泳驗證，兩者結果一致，說明基于HNB染料的LAMP方法結果可信。本方法能檢測到約17 fg布魯氏菌基因組DNA，相當于5個布魯氏菌基因組拷貝。另外，R.Ohtsuki等采用LAMP法，在BCSP31基因區段設計引物，也檢測到10 fg的布魯氏菌基因組DNA[13]，其結果與本研究相符。在進行特異性檢測時，9株布魯氏菌反應管全部從紫色變為天藍色，而4株陰性對照菌反應管仍為紫色，顯示本方法良好的特異性。將本方法與經典的B4/B5-PCR方法進行比較，對60份RBT陽性血清樣本進行檢測時，兩者結果總符合率達85.0%。B4/B5-PCR檢測為陽性的43份樣品經本方法檢測全部為陽性；B4/B5-PCR檢測為陰性的17份樣本，經本方法檢測，其中9份為陽性，8份為陰性。由于B4/B5-PCR的靈敏性通常在1 pg左右，可見本方法的靈敏性明顯高于B4/B5-PCR。

本研究建立了布魯氏菌LAMP可視化檢測方法，整個反應在63℃恒溫條件下進行60 min便能直接判定結果，簡便易行，可用于基層對布魯氏菌的快速檢測。

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